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《厦门大学》 2002年
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一、甜菊UDPG糖基转移酶基因的克隆和功能分析 二、甜菊肌动蛋白和EF1α基因的克隆、序列分析和分子进化研究

马凌波  
【摘要】: 甜菊(Stevia rebaudiana)叶片中富集了约占干重10-30%的甜菊糖苷。以二萜类化合物甜菊醇(Steviol)为糖苷非糖配基,根据13位上的羟基和19位上的羧基上以O-糖苷键相连的糖基种类及数最不同,已有至少8种糖苷被发现。甜菊糖苷生物合成过程与赤霉素生物合成密切相关。已有研究表明赤霉素合成过程中的一些酶,在甜菊叶片细胞内的含量及其活性都比较高,表达方式也与其它植物有较大的差异,这将导致赤霉素和甜菊糖苷的共同前体物质内贝壳杉烯酸的大量积累。为了避免合成过量的赤霉素,这些前体物质被转化成为甜菊醇,并被糖基化形成甜菊糖苷。类黄酮UDPG糖基转移酶很有可能在甜菊糖苷的合成过程中起了重要作用,保证了赤霉素的代谢正常进行。为了证实这一点,实验克隆得到了甜菊类黄酮UDPG糖基转移酶基因,并对其功能进行了分析。 利用与植物次生代谢产物糖基化相关的UDPG糖基转移酶的特征性保守区域,设计了同源简并引物,以甜菊基因组DNA为模板,PCR扩增获得甜菊糖基转移酶基因片段GTASE-Ⅰ和GTASE-Ⅱ。基因片段包括了UDPG糖基转移酶基因的部分特征性序列。与其他同类UDPG糖基转移酶基因的氨基酸序列比较,具有较高的相似性,达53%至70%,约40%-50%氨基酸序列完全一致。表明获得的基因片段属于UDPG糖基转移酶。根据获得的基因片段设计引物,分别与cDNA文库的T3和T7通用引物配合,以cDNA文库为模板,扩增获得甜菊糖基转移酶基因Gt1和Gt2全长的核苷酸序列。获得的甜菊糖基转移酶Gt1基因全长1568bp(GenbankTM序列号:AF515727),包括一个1419bp的开放阅读框,编码473个氨基酸。Gt2基因全长1662bp(GenbankTM序列号:AF548025),包括一个1362bp的开放阅读框,编码454个氨基酸。Gt1和Gt2基因与常见的糖基转移酶基因的相似性分别达26-46%和44-74%。Gt1和Gt2都具有UDPG糖基转移酶的44个氨基酸的特征性保守序列,它被认为是UDP-glucose的结合区 厦门大学博d二庵开究生学位创含文 域。实验对Gtl基因进行了原核融合表达,获得的融合蛋白的大小约55kDa。功 能分析表明,纯化后的Gtl融合蛋自以UDPG为糖基供体,能以甜菊醇(steviof) 以及花青素(eyanidin)、飞燕草素(delphinidin)、芍药花素(伴on,din)和锦葵 花素(malvidin)等花色素为糖基受体合成甜菊糖昔和花色素昔。其中,对花青 素的催化活性最高,对甜菊醇的活性为花青素的33.5%。结果表明,Gtl作为甜 菊体内的类黄酮糖基转移酶,具有广泛的底物特异性,它不仅参与类黄酮的糖基 化,而且能够作用于甜菊醇,形成甜菊糖昔。在大量的GA前体物质被合成,使 甜菊的正常代谢受到了威胁的情况下,甜菊很有可能利用了细胞内的类黄酮糖基 转移酶基因合成惰性的甜菊糖苔。
【学位授予单位】:厦门大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:S566.9

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