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海洋真菌BYY-1代谢产物Clavatol的发酵条件及生物活性研究

黄珊珊  
【摘要】: 我们课题组前期从采自福建省云霄县漳江口红树林湿地自然保护区的白骨壤树叶样品中分离到一株海洋真菌BYY-1,并从该菌株的次级代谢产物中分离鉴定了一个聚酮类化合物Clavatol。初步的研究结果显示,Clavatol发酵产量较高,分离纯化步骤简单,体外抗肿瘤活性强,具有进一步的研究价值。本论文在原有的工作基础上对Clavatol的发酵条件进行优化,并对该化合物的生物活性进行较系统的研究,为Clavatol进一步开发及应用提供依据。 采用通过正交试验法对Clavatol的发酵培养基进行优化,确定了Clavatol适宜的发酵培养基组成为:葡萄糖1%,蛋白胨0.2%,酵母膏0~1.0%,海水0~10%,硫酸铵0.3%。采用该发酵培养基,在28℃,160r/min摇瓶振荡发酵7d, Clavatol发酵产量可达44.6mg/L。 采用微量液体稀释法对Clavatol的抗菌活性进行测定,发现其对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色假丝酵母和黑曲霉的MIC分别为156、160、85、26、38μg/mL。 首次研究了Clavatol对酪氨酸酶和乙酰胆碱酯酶的抑制作用,结果显示,Clavatol对酪氨酸酶和乙酰胆碱酯酶的IC_(50)均为6.94μmol/L,对2种酶的抑制作用均表现为可逆效应,为竞争性抑制剂,抑制常数Ki分别为0.166μmol/L和0.037mmol/L。Clavatol对酪氨酸酶和乙酰胆碱酯酶的荧光发射光谱随着其浓度的增高,内源荧光产生有规律的猝灭,但荧光的最大发射峰位置未发生明显的位移,说明该化合物与两种酶之间存在着相互作用。 对Clavatol的抗氧化活性进行测定,首次发现Clavatol对H_2O_2自由基和DPPH具有较强的清除作用,IC_(50)分别为6.25μg/mL、7.15μg/mL。 采用MTT法对Clavatol的体外抗肿瘤活性进行测定,结果显示,该化合物对Raji、Hela、MG-63、BGC-823、KB、HepG-2细胞的IC_(50)分别为24μg/mL、12μg/mL、32μg/mL、28μg/mL、16μg/mL和46μg/mL。 采用DAPI染色、流式细胞术、磷脂酰丝氨酸外翻分析、线粒体膜势能(ΔΨm)的检测、ROS检测、和Western Blotting等多种测定方法对Clavatol诱导肿瘤细胞凋亡的作用进行分析,确定Clavatol可诱导Hela肿瘤细胞凋亡,但诱导凋亡的机制还有待进一步研究。 对Clavatol的急性毒性和体内抗肿瘤活性进行了评价,结果显示,Clavatol对小鼠的LD50为1000-1250mg/kg体重,对小鼠肉瘤细胞s-180的体内抑瘤实验,ED50为111.87mg/kg体重,治疗指数达到了10.61。与目前临床上的一些抗癌药物相当,对该药今后的研究开发有重要意义。 在前期对菌株BYY-1进行初步鉴定的基础上,根据rDNA ITS序列分析测序结果,将菌株BYY-1鉴定为Aspergillμs clavatonanicμs. 本文结果表明,Clavatol发酵产量较高,分离纯化步骤简单,毒性较低,抗肿瘤、抗氧化、抗酪氨酸酶和乙酰胆碱酯酶活性较强,具有良好的开发前景。


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