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《厦门大学》 2007年
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微胶囊固定化重组大肠杆菌萃取发酵生产L-苯丙氨酸的研究

罗世翊  
【摘要】: 作为人体八种必需氨基酸之一的L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine, L-Phe),是一种重要的合成中间体,在食品和医药领域有广泛的应用,可作为食品添加剂、抗癌药物中间体和合成阿斯巴甜的原料,具有非常广阔的市场前景。 利用固定化重组大肠杆菌细胞发酵生产L-Phe,是当前制备L-Phe应用最广泛的一种方法。本文利用两种新型微胶囊——SA-CMC/CaCl_2微胶囊体系与NaCS-PDMDAAC微胶囊体系对重组大肠杆菌进行固定化,探索了它们在萃取发酵生产L-Phe过程中的特性,并与游离细胞培养作了比较,试图对实验室探索L-Phe的工艺以及大规模生产L-Phe提供理论依据。 论文先对有机溶液萃取分离L-Phe作了比较系统的研究:以磷酸二(2-乙基己基)脂(D2EHPA)为萃取剂,环己烷为稀释剂萃取L-Phe,研究了L-Phe浓度、D2EHPA浓度、温度对萃取分配系数D的影响,以及负载L-Phe有机相的反萃取特性。结果表明:萃取分配系数D随温度的升高而降低,而L-Phe浓度对分配系数的影响还与水相初始pH值有关;萃合物是以一个L-Phe分子和二个D2EHPA分子结合而成。在利用酸溶液对负载L-Phe有机相的反萃取过程中,反萃取的效果符合HCl HNO_3≥H_2SO_4 CH_3COOH,且随HCl浓度和温度的升高而升高。 然后研究了游离重组大肠杆菌细胞生长特性,结果表明:在游离培养的情况下,培养12 h时即可达稳定期,葡萄糖也在这一时间段内被迅速消耗,到14 h时葡萄糖已消耗完全,而L-Phe的产量在对数期(10 h左右)达到峰值,但此后出现一定的下降,这可能是在游离培养达稳定期时被细胞消耗所致。萃取剂对重组大肠杆菌具有毒害作用,所以在后续的研究过程中,必须避免使菌体细胞直接与萃取剂进行接触。而两种新型固定化体系——SA-CMC/CaCl_2微胶囊体系和NaCS-PDMDAAC微胶囊体系具有良好的生物相容性,可用于重组大肠杆菌的发酵生产过程。 接下来研究了SA-CMC/CaCl_2微胶囊固定化重组大肠杆菌萃取发酵生产L-Phe,先是确定了有利发酵过程的微胶囊制备浓度:12~14 g L~(-1)的CMC,8~10 g L~(-1)的SA,12~14 g L~(-1)的CMC,80~100 g L~(-1)的CaCl_2。然后考察了不同制备浓度制备的微胶囊的机械性能,结果表明SA-CMC/CaCl_2微胶囊在萃取剂存在的情况下稳定性非常差,其中以12.0 g L~(-1) CMC、10.0 g L~(-1) SA、100.0 g L~(-1) CaCl_2制备得到微胶囊的稳定性相对较好。最后考察以12.0 g L~(-1) CMC、10.0 g L~(-1) SA、100.0 g L~(-1) CaCl_2制备得到的微胶囊固定化重组大肠杆菌萃取发酵生产L-Phe的情况,结果表明:由于受传质的影响,SA-CMC/CaCl_2微胶囊固定化培养的延迟期延长了2 h左右,但最终的菌体浓度略为升高;另外在生长末期,微胶囊固定化情况下的L-Phe没有明显的消耗;同时,在0 h时加入萃取剂的微胶囊固定化萃取发酵过程的产量约为1.70 g L~(-1) L-Phe;14 h的产量约为10.40 g L~(-1) L-Phe。 最后考察了NaCS-PDMDAAC微胶囊固定化重组大肠杆菌萃取发酵生产L-Phe,先确定了有利发酵过程的微胶囊制备浓度:3%~4%的NaCS,4%~5%的PDMDAAC。然后考察了不同制备浓度下制备的微胶囊的机械性能,结果表明NaCS-PDMDAAC微胶囊具备非常良好稳定性,并不受萃取剂的影响。综合考虑传质因素,认为以3%的NaCS,4%的PDMDAAC制备得到微胶囊用于固定化重组大肠杆菌培养更好。研究以3%的NaCS,4%的PDMDAAC制备得到的微胶囊固定化重组大肠杆菌萃取发酵生产L-Phe,结果表明:由于NaCS-PDMDAAC微胶囊囊膜非常致密,受传质影响,NaCS-PDMDAAC微胶囊固定化培养的延迟期比游离培养延长了4 h左右,比SA-CMC/CaCl_2微胶囊固定化培养延长了2 h左右,而且最终的菌体浓度相对偏低、葡萄糖并未完全消耗,最终的残糖浓度约为4 g L~(-1)左右;另外,在生长末期,L-Phe不存在消耗过程;同时,在0 h时加入萃取剂的微胶囊固定化萃取发酵产量约为12.50 g L~(-1) L-Phe;22 h的产量约为13.16 g L~(-1) L-Phe。
【学位授予单位】:厦门大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:TQ922.9

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【引证文献】
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