两株海洋真菌生理活性物质的初步研究

【摘要】： 近年来海洋真菌已成为研究活性天然产物的重要资源,已从中得到了一定数量的具有生理活性的化合物,由于其独特的生境,为了适应海水中盐度、压力、低温等生存条件,有可能会产生一些具有独特化学结构的次级代谢产物,从中有可能发现与现有药物不同的新的活性物质,成为治疗肿瘤、感染、老年痴呆等顽固性疾病的前体药物。 本论文对两株海洋真菌CB-2和HLY-2的次级代谢产物进行了研究。菌株CB-2经ITS分析及形态鉴定,确定为Articulospora sp.。对两株菌的次级代谢产物展开了初步研究。从菌株CB-2中得到了6个化合物,其中2个化合物CB-4和CB-6经结构解析确定为4,6-二羟基-2,3-二甲基-苯甲酸甲酯和3-(4-羟基-苯甲基)-哌嗪-2,5-二酮。从菌株HLY-2中得到了4个化合物,H-2和H-3是两个同系物,H-2的化学名称为7-羟基-4,6-二甲基-3H-异苯呋喃-1-酮,H-3的化学名称为7-甲氧基-4,6-二甲基-3H-异苯呋喃-1-酮,都为异苯并呋喃类的化合物,其中H-2的晶体结构为首次报道。H-4是一个已知的抗生素Nectriapyron,化学名称为4-甲氧基-3-甲基-6-(1-甲基-丙烯基)-吡喃-2-酮。H-6为麦角甾醇类的化合物。 对其中的四个产量比较大的化合物进行了生理活性的测试,具有抗肿瘤活性的是H-2和H-3,对Raji细胞的IC50分别为15μg/mL和7.8μg/mL,具有抗氧化活性的是H-2、CB-4和CB-6,对DPPH的清除率的IC50分别是61.2μg/mL、15.8μg/mL和200μg/mL。CB-4和CB-6有微弱的抗金黄色葡萄球菌活性,MIC均为100μg/mL。H-2和CB-6有微弱的抗橙色青霉的活性,MIC均为200μg/mL。 本论文还对来自菌株HLY-2的化合物mycoepoxydiene的发酵条件进行了优化,通过正交设计,用琼脂表面发酵液体发酵两种方式,各进行了25次实验,得到了最优的培养基配方。在液体发酵条件下最佳培养基为:马铃薯100g/L,海水200mL/L,葡萄糖100g/L,乳糖50g/L,磷酸二氢钾0.5mmol/L,硫酸铵1g/L;琼脂表面发酵的是:马铃薯250g/L,海水300ml/L,葡萄糖30g/L,乳糖50g/L,磷酸二氢钾0.65 mmol/L,硫酸铵1g/L。该化合物的产量由原来普通PD培养基液体发酵的17mg/L,上升到了36.6mg/L和521mg/L,分别提高了2倍和16倍。对两种发酵条件下产量、生物量和培养基组分的变化进行了研究,发现两种方式下,HLY-2对碳源、氨态氮和磷酸盐的利用上有一些区别。 用正交设计中得到的最佳培养基,琼脂表面发酵菌株HLY-2 10L,通过RP-18反相硅胶柱层析和重结晶等技术,得到纯化合物mycoepoxydiene约1.5g。在急性毒性实验中,化合物mycoepoxydiene对小鼠的LD50为125.98 mg/kg体重,对小鼠肉瘤细胞s-180的体内抑瘤实验,ED50为11.87mg/kg体重,治疗指数达到了10.61。与目前临床上的一些抗癌药物相当。对接种于裸鼠的人胃癌细胞BGC-823也表现出了良好的抑瘤活性,在14mg/kg的剂量时,抑制率达到了42.62%,并且没有引起动物体重下降。说明MycoE对人类肿瘤也是有效的,对该药今后的研究开发有重要意义。 对化合物mycoepoxydiene的抑瘤机理进行了初步研究。通过形态观察、流式细胞术、彗星电泳和DNA梯度电泳几种方式,发现该化合物对Raji细胞抑制并不是诱导凋亡,有可能是使细胞坏死或类似于坏死的一些方式。 本文结果表明,两株海洋真菌都有较好的生理活性,其次级代谢产物都有继续研究的意义,化合物mycoepoxydiene有潜力成为新型的抗肿瘤药物。