南极中山站沉积物中微生物多样性分析及宏基因组文库研究

【摘要】： 微生物在南极的生态系统中扮演着重要的角色,微生物生态可较敏锐地反映整个南极生态系统的变化。同时,南极所具有独特的地理及气候特征,造就了极地微生物特殊的生理特征和适应机制。因此南极微生物不但在南极的生态系统及物质的生物地球化学循环中扮演了重要角色,在基础研究和开发应用方面也具有广阔的前景。南极中山站排污入海口沉积物环境是受人类影响较大的区域之一,外来营养物质的引入不仅使该环境中的微生物群落发生变化,而且可能刺激“土著”微生物的次级代谢,产生新的特殊活性物质。 本文首先通过DGGE技术对南极中山站排污入海口(ZSS)及其周围200米近岸(ZSN)沉积物样品中细菌和古菌微生物群落结构及其多样性进行了调查,结果表明所调查区域存在非常丰富的微生物资源。在这两个位点检测到了比以往关于南极微生物报道的更丰富的细菌类群:α-,β-,γ-,δ-,ε-变形细菌群(α-,β-,γ-,δ-,ε-Proteobacteria),噬纤维菌—黄杆菌—拟杆菌群(Cytophaga/Flavobacterium of Bacteroidetes,CFB group),放线菌群(Actinobacteria),芽单胞菌群(Gemmatimonadetes),革兰氏阳性菌(Gram positivegroup),绿屈挠菌群(Chloroflexi),浮霉状菌群(Planctomycete),酸杆菌群(Acidobacteria)和一个未知类群。并且分析表明,来自于排污入海口的细菌多样性较周围地区更为丰富。同时在所调查样品中也检测到了广生古菌界(Euryarchaeota)的4个类群和泉古菌界(Crenarchaeota)的1个类群,但分析表明在古菌方面,ZSS环境样品较为单一,主要集中在广生古菌界(Euryarchaeota)3个产烷微生物类群,并且所检测的古菌序列与数据库中已知序列的同源性较低。 其次,本文采用宏基因组技术,通过构建环境样品PKSI—KS和NRPS—A功能基因克隆文库,应用分子生物学方法,开展了南极ZSS和ZSN样品中与次级代谢产物相关基因(簇)的微生物功能基因多样性研究,并对功能基因类型及其可能所归属的微生物群落进行了分析。结果表明,在KS基因方面,来自两个样品的所有31个序列(ZSS,14;ZSN,17)属于多样的细菌类群,包括变形细菌(Proteobacteria),革兰氏阳性菌(low G+C gram positive bacteria),浮霉状菌属(Planctomvcetes),蓝细菌/蓝藻(Cyanobacteria),放线菌属(Actinobacteria),和未/无法培养的海绵共生菌(uncultured sponge marine-associatedmicroorganisms)。并且有5个基因类型在系统发育树上无法归属于已知的类群而形成独立的分支。同时,系统发育树还显示出一个区别于以往所报道的杂合型PKS/NRPS基因类型(hybrid PKS/NRPS enzyme complexes)。在A基因方面,所获得31个序列(ZSS,13;ZSN,18)主要集中在蓝细菌/蓝藻(Cyanobacteria)和变形细菌类群(Proteobacteria)。本研究中几乎所有氨基酸序列与GenBank数据库中最接近的已知序列同源性较低(KS,＜80%;A,＜60%),表明南极环境中可能蕴含着丰富的与次级代谢产物相关的基因,并且有可能发现新的独特的由微生物产生的天然产物。 第三,本文构建了南极中山站排污入海口沉积物中微生物ZS cosmid宏基因组文库,获得了约6500个阳性克隆,推算该文库至少包含了228Mb南极环境样品DNA,可以覆盖约10株类似E.coli菌株的总基因组。采用PCR扩增和菌落原位杂交,定位到了4个与次级代谢产物相关基因的克隆,对其中一个具有潜在A基因的克隆(ZSK-90)进行了基因组测序,插入片段全长41,263bp。从中获得了一完整的非核糖体多肽合成酶(NRPSs)基因簇,长约11kb,这是国内首次从南极环境样品宏基因组文库中筛选到的与次级代谢产物相关的基因簇,本研究对其基因类型,保守序列等方面进行了初步分析,推测该酶基因簇第一组件腺苷化结构域(A)可能特定的活化缬氨酸(Val)。由于所获得的序列与数据库中已知序列同源性较低(＜43%),推测可能产生目前尚未发现的新型化合物结及其代谢途径。 第四,本文首次运用DDRT法与环境样品宏基因组文库相结合,从该文库得到了约10个作用于DNA具潜在抗肿瘤活性的克隆子,采用MTT法对其中活性较高的克隆子进行细胞毒活性测定,表明克隆子ZSE-3对卵巢癌细胞的抑瘤率达55%,同时该克隆对金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌和白假丝酵母显示出拮抗活性。目前,对ZSE-3活性物质结构进行了初步研究。本研究还通过功能平板从该宏基因组文库中筛选到了部分具有蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶活性的阳性克隆,并且获得了一株能在碱性pH13条件下产生蛋白酶活性的克隆。 我们所构建的宏基因组Cosmid文库包含了丰富的微生物基因组,克服了传统培养方法的局限性,获得了丰富的极地微生物遗传信息;而且其中包含的微生物绝大多数是尚未培养或鉴定的新的菌群或菌种,为寻找南极沉积物中微生物的功能基因和新基因以及生长适应机制等方面的研究提供了丰富的素材。预期随着后续研究的进一步开展,该宏基因组文库中可能发现更多的活性物质和极端环境微生物特殊的代谢途径。