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钙离子信号途径依赖性磷酸酶PP2B和PP1α协同激活P-TEFb复合体的分子机制

刘敏  
【摘要】: 在真核细胞中,编码蛋白的基因的转录均由RNA聚合酶Ⅱ(RNA PolⅡ)来完成,其转录过程大致由起始前复合物组装、起始、启动子区清扫、延伸和终止等紧密衔接的步骤组成。近年来研究发现原先最不受重视的转录延伸步骤其实是细胞调控转录最重要、也最复杂的调控平台。其中正性转录延伸因子b复合体(positive transcription elongation factor b,P-TEFb复合体)被证明是协调转录延伸步骤的最重要的因子之一。P-TEFb复合体是由CDK9及CyclinT1组成的异二聚体激酶,在转录延伸过程中可磷酸化RNA polⅡ大亚基CTD上第2位丝氨酸,并克服负性延伸因子对转录延伸的抑制作用,从而保证全长mRNA的转录。作为基本转录因子,P-TEFb复合体不仅是细胞内绝大多数基因转录所必需的因子,其活性的异常调控与心肌肥大和癌症等疾病也有直接或间接的关联。更重要的是,P-TEFb复合体也是艾滋病病毒(HIV-1)转录复制过程中所必需的宿主细胞因子之一。本实验室的前期研究揭示了P-TEFb复合体活性调控的分子模式:即核蛋白HEXIM1通过核小RNA 7SK snRNA与P-TEFb复合体结合并形成无活性的7SK snRNP复合物,任何导致该复合物解离的因素均可活化P-TEFb复合体的转录活性。因此,了解细胞内调控P-TEFb复合体活化的信号途径和分子机制对于了解上述重大疾病的病因具有重要的科学意义。但迄今为止,对调控P-TEFb复合体活化的信号途径和分子机制仍知之甚少。 本文针对调控P-TEFb复合体活化的信号途径及其分子机制展开研究,发现P-TEFb复合体的活化需通过两条不同的信号途径之间的协同作用来完成。首先,为探讨P-TEFb复合体活化的信号途径,我们对能够诱导P-TEFb复合体活化的胞外刺激因子进行了筛选,发现DNA损伤诱导因子、缺氧条件、酸性或细胞分化诱导剂HMBA等因子均能激发P-TEFb复合体的活化。提示P-TEFb复合体似乎作为多种胞内重要的生理信号途径的整合节点,协调并影响生理或病理转变中的特异性转录。采用UV和HMBA这两种经典的P-TEFb复合体活化因子处理HeLa细胞,发现均能引发HeLa细胞的钙离子内流,其后采用多种信号途径特异性抑制剂和分子生物学手段抑制或增强钙信号途径均可相应地拮抗或激发P-TEFb复合体的活化,从而证实钙离子/PP2B(calcineurin)信号通路是应答胞外刺激、调控P-TEFb复合体活化所必需的信号途径。但之后又发现该途径单独并不能直接活化P-TEFb复合体,提示需要第二条信号通路的协同作用。随后鉴定发现蛋白磷酸酶PP1α信号途径也是必需的途径之一,而且和钙离子/PP2B途径相类似,PP1α途径单独同样也不能起作用。采用共转染和共处理等分子生物学及生物化学方法,我们发现PP2B和PP1α在体内和体外均能直接并且有效地协同活化P-TEFb复合体,同时发现PP2B的去磷酸化作用必需先于PP1α的去磷酸化作用,表明两条不同的信号途径所介导的两步去磷酸化是活化P-TEFb复合体的关键机制。采用特制的抗磷酸化抗体,证实CDK9 T-loop上磷酸化的Thr186(pT186)是由PP1α去磷酸化的,并且发现该位点的去磷酸化是调控P-TEFb复合体活化的关键位点。我们的研究结果表明细胞外刺激因子可通过细胞内钙离子/PP2B及PP1α两条主要信号途径传导,并通过协同作用而激活P-TEFb复合体的活性,其中PP2B的去磷酸化作用可能是将CDK9 T-loop上的pT186暴露给PP1α并由PP1α对该位点进行去磷酸化,最终导致7SK snRNP复合物的解离而解除对P-TEFb复合体的抑制,从而激活P-TEFb复合体的转录活性。


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