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《厦门大学》 2009年
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文蛤多肽的研究与应用

范成成  
【摘要】: 癌症是目前死亡率最高的疾病,是名副其实的“头号杀手”。从天然生物中筛选出能与癌症发生、发展、形成等过程中各调节靶点特异结合的活性成分,已成为寻找抗癌药物的新热点。目前各国学者采用现代科学方法与技术从海洋生物中分离和鉴定出了多种具有抗肿瘤活性的天然物质,为研制开发抗肿瘤新药奠定了基础,显示出诱人的研究开发前景,从海洋生物及其代谢产物中筛选和提取具有特异化学结构的天然活性物质成为抗肿瘤药物开发的重要来源。文蛤(Meretrixmeretrix Linnaeus)作为一种深受人们喜爱的海洋软体动物,不仅具有丰富的营养价值,更是有着极高的药用价值。古往今来,文蛤的药用价值一直深受人们的重视,它具有清热利湿、化痰、散结的功效,对肿瘤细胞有明显的抑制作用,还具有降血糖,降血脂,抗衰老等多种生理功能。其有效成分及生理作用受到越来越广泛的关注。 本研究采用破碎、硫酸铵沉淀、乙醇抽提、Sephadex G-25分子筛层析等方法从文蛤中提取得到四个峰的物质,利用MTT法分别检测各峰体外对癌细胞的抑制效应,发现第二峰的物质能抑制癌细胞的生长,将此活性物质命名为Mer2;发现第一个峰的物质能抑制酪氨酸酶的活性,减少黑素的形成,命名Mer1。 将Mer2处理肝癌HePG_2细胞、胆管癌QBC939、宫颈癌Hela细胞、肺腺癌细胞SPC-A-1、LTEP-a-2,观察研究Mer2对癌细胞的生物学效应并进一步探索其抑制癌细胞生长的作用机理。结果表明,Mer2对五种细胞均有不同程度的抑制作用,但对正常的人肝chang-liver细胞抑制作用很小。当浓度大于10μg/mL时,作用时间为72 h时,对肝癌HePG_2细胞和胆管癌QBC939的抑制率便超过了50%,其中对肝癌HePG_2细胞的抑制作用更强一些。通过光学显微镜和流式细胞技术等方法,研究了文蛤多肽对体外培养的肝癌HePG_2细胞和胆管癌QBC939的细胞形态、细胞周期的影响。结果表明:Mer2处理后的细胞外形变化明显,贴壁细胞数量减少,出现了单个细胞的悬浮生长,细胞的集落化程度降低,细胞群体数量显著降低,出现了凋亡小体。细胞周期的检测结果说明,经Mer2处理的肝癌HePG_2细胞周期发生明显变化,出现明显的凋亡峰,但细胞周期未出现明显阻滞现象。表明文蛤多肽对癌细胞的生长抑制作用与细胞凋亡有关。 进一步研究文蛤抗癌多肽抑制癌细胞的分子机制,我们利用蛋白组学双向电泳技术初步探讨了在经Mer2作用前后肝癌HePG_2细胞蛋白表达的变化,以期为后续的研究提供理论基础。通过图谱分析找到89个差异蛋白,其中66个表达下调,23个表达上调。对其中部分差异较明显的点进行了鉴定,最终鉴定出9种差异蛋白。其中7个蛋白表达下调,2个蛋白表达上调。肝癌细胞HePG_2表达的差异蛋白种类涵盖了从细胞结构到细胞生理调控的各个方面。对差异点进行鉴定后发现,差异蛋白有锌指蛋白(Zinc finger protein 624),膜联蛋白(Annexin A2),细胞骨架蛋白(keratin 1,typeⅡ,cytoskeletal),分子伴侣蛋白(TCP-1-beta),线粒体核糖体蛋白(mitochondrial ribosomal protein L27),DNA修复蛋白,肿瘤抑抑制蛋白以及其他的蛋白等,并对部分差异点的功能进行了初步探讨。 采用动力学研究方法,体外研究了Mer1对蘑菇酪氨酸酶(Tyrosinase)活力的影响。结果表明Mer1对酪氨酸酶有较强的抑制作用,抑制过程呈浓度的关系,抑制作用是一种可逆过程,为反竞争性抑制,使酶活力丧失50%的抑制剂浓度(IC_(50))为95μg/mL,抑制常数(K_(IS))为60.98μg/mL。我们还研究了Mer1对小鼠黑素瘤B16生长的影响,发现Mer1不会抑制黑色素瘤细胞的生长,能降低细胞内酪氨酸酶的活性和黑色素的含量,具有清除自由基的能力,具有一定的抗氧化活性是一种安全无毒副作用的美白添加剂,具有潜在的防止褐斑、美白肌肤的作用。
【学位授予单位】:厦门大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R284

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【参考文献】
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