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纳米金对聚合酶链式反应的影响及其机制研究

李辉  
【摘要】: 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是生物医学领域最常用、最重要的技术之一,它能够实现DNA片段的体外扩增,可以满足后续的分析测试需要,因此是许多临床检测和生物分析的基础。纳米技术的发展以及与生物技术的融合,为解决生物技术中的问题提供了机遇,纳米物质对于PCR反应的影响也日益受到人们的关注。本论文研究了纳米金对PCR反应的影响,并对其影响PCR反应的机制进行了探讨。实验结果表明: 1.往PCR体系中加入一定量的纳米金(0~1.2 nM)之后,PCR反应被抑制,并且这种抑制作用与纳米金的浓度有关,纳米金的浓度越大,PCR反应产物的产量就越少,当纳米金浓度大于1.0 nM时PCR反应甚至被完全抑制,得不到扩增产物。 2.提高Taq DNA聚合酶的浓度至初始浓度的1.6倍,即可有效地解除纳米金对PCR反应的抑制,而分别提高PCR体系其他组分(Mg~(2+)、dNTP、引物、模板等)的浓度至初始浓度的6倍,仍无效。 3.提高Taq DNA聚合酶的浓度可以有效解除纳米金对PCR反应的抑制,再次提高纳米金的浓度,PCR反应又被抑制,如果再次提高Taq DNA聚合酶的浓度又可以解除抑制。说明纳米金与Taq DNA聚合酶的相互作用是导致PCR抑制的主要原因。 4.在含有1.0 nM纳米金的PCR体系中,保持Taq DNA聚合酶的浓度(1.25 U/μL)不变,添加牛血清蛋白(BSA),当其浓度大于0.04μg/μL时也可以解除纳米金对PCR反应的抑制说明,BSA和Taq DNA聚合酶可以竞争性地与纳米金相互作用。 5.纳米金与Taq DNA聚合酶混合体系的紫外可见吸收光谱结果显示:纳米金的吸收峰由518 nm红移到527 nm,并且吸收峰变宽;粒径分析结果显示,粒径变大;X射线光电子能谱图上出现了Au和N的吸收峰。这些结果均证明,纳米金与Taq DNA聚合酶和BSA之间存在相互作用。 6.圆二色谱结果表明,纳米金与BSA相互作用后BSA的α-螺旋含量由63.1%降低为47.7%说明,BSA的构象发生了改变,并且纳米金的浓度越高,BSA的构象改变就越大。 7.提出了纳米金抑制PCR扩增的机制:纳米金与Taq DNA聚合酶相互作用后导致其构象发生了改变,降低了酶的活性,导致PCR的扩增效率降低。


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