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《华侨大学》 2011年
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对鞘翅目害虫具有活性的新型cry基因的研究

茅洁瑜  
【摘要】:鞘翅目害虫常年给农、林业生产带来重大损失,目前采取的主要防治措施是使用化学杀虫剂,但是化学杀虫剂的弊端日益突出。一方面化学杀虫剂对生态系统影响大、药物残留高、对人畜安全性低,另一方面部分害虫已经对其产生抗性。为了减少污染、提高防治效率,国内外都在探索生物防治这一新的防治技术和方法。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是目前研究应用最广的一类微生物杀虫剂。Bt的杀虫活性与其携带的编码杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)的cry基因密切相关,寻找新的高毒力菌株及基因一直是研究的热点。本文应用PCR-RFLP和生物信息学两种方法开展对鞘翅目有活性的新cry基因的挖掘工作,并对所寻找到的新基因进行了表达研究,主要结果如下: 1.以实验室分离的500株苏云金芽胞杆菌菌株为材料,通过杀虫活性测定筛选到43株对鞘翅目金龟科幼虫(蛴螬)有活性的菌株,其中菌株C9对三种供试昆虫均有活性。形态学观察发现这些菌株均释放球形晶体,SDS-PAGE分析显示它们均表达约130 kDa蛋白。采用PCR-RFLP法对这43株菌株进行了cry基因类型鉴定,结果显示:其中21株只含cry8Ca;13株同时含cry8Ca和cry8Ea基因;菌株QCM的PCR-RFLP图谱不同于已发现的cry8基因,说明其中含有新基因。根据已知的cry8基因全长序列设计引物,成功克隆了该新基因,由Btδ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry8Xxx1。 2.从已进行基因组测序的菌株NARC Bt17和HD868中,通过生物信息学方法筛选到3个对鞘翅目害虫有潜在毒力的新cry基因。成功克隆了上述基因,并命名为cry61Xxx、cry7Xxx和cry8Ma3。 3.以大肠杆菌Rosetta (DE3)为宿主菌,利用表达载体pEB对所克隆的4种新cry基因进行表达,经SDS-PAGE检测,均成功表达130 kDa左右的蛋白。 4.通过穿梭载体pSTK将cry8Xxx基因导入Bt无晶体突变株HD73-中,获得工程菌HD8X。SDS-PAGE分析表明cry8Xxx基因在其中能正常表达,并形成球形晶体。 综上所述,本研究通过PCR-RFLP与生物信息学筛选的方法,克隆了4种新cry基因,构建了新型Bt工程菌HD8X,丰富了我国对鞘翅目有活性的基因资源,拓宽了cry基因挖掘的思路,并为应用奠定了基础。
【学位授予单位】:华侨大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S433

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