高通量筛选促进重组腺相关病毒载体表达的microRNA

【摘要】：近年来，基因治疗已取得长足的进展，全世界已有上千例基因治疗研究进入临床试验，涉及的疾病类型不仅有先天性遗传疾病如血友病，也有许多人类高危高发性疾病，目前基因治疗的范围已从遗传病领域扩展到肿瘤、癌症、心血管疾病、神经系统疾病、传染病（包括AIDS）等领域。但无论基因治疗对人类健康的潜力如何，基因药物载体的局限性使得基因治疗无法完美实现。 基因药物载体从裸露DNA载体、非病毒载体到病毒载体发展而来，rAAV基因药物载体这一后起之秀格外引人注目，腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）属于细小病毒家族，是一种单链无包膜的病毒，具有宿主范围广、非致病性、能长期稳定表达外源基因等优点，AAV被开发成为基因治疗载体——重组腺相关病毒（Recombinant adeno-associated virus，rAAV）载体，被认为是最有前景的基因治疗载体之一。大量有关腺相关病毒的临床试验仍在进行或准备中，主要用于治疗肌肉和眼部疾病。 长期以来研究人员一致认为重组腺相关病毒载体具有无致病性、低免疫原性，前期涉及啮齿类及灵长类动物的大量临床前研究也从未发现会引起严重不良反应。然而最近的血友病基因治疗临床试验表明，AAV2外壳启动了CD8+T细胞介导的免疫反应，对转导载体的肝细胞产生细胞毒性导致治疗失败。由美国宾州大学主持的治疗血友病的rAAV基因药物I/II期临床研究也发生了严重的细胞免疫反应，临床研究被迫终止。除了免疫反应之外，rAAV基因药物治疗AAT基因缺陷、帕金森病的临床试验被证明基本无效。更多临床研究出现的安全性和有效性问题，对rAAV载体的表达效率提出了更高的要求。 如何提高rAAV载体的表达效率是一项紧迫而又艰巨的任务，用于治疗基因的RNAi给rAAV载体表达效率的提高带来了新希望。由于载体和治疗基因是基因药物中的两个关键，目前基因药物设计思路中，载体只是单纯的用来运载治疗基因，而很少考虑治疗基因对载体本身的影响。 一些治疗基因，在发挥抗肿瘤作用的同时，还可提高载体的基因表达效率。2009年Johnson团队研究发现，siRNA介导的沉默核仁磷酸蛋白和抑制核仁蛋白，能分别使rAAV载体的基因表达效率最高可提高15倍和30倍。2011年Wallen团队从5520个siRNA文库中，筛选出50个能明显促进rAAV基因表达的siRNA（rAAV基因表达高于8倍）。 以上研究不但证明了利用RNAi技术可显著提高rAAV载体的表达效率，也为本论文提供了良好的借鉴。同样具有RNAi作用的miRNA可能也可以提高rAAV载体基因表达效率。本论文将探索miRNA与rAAV之间的关系，用近2000个miRNA文库，在人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）中筛选促进rAAV表达效率的miRNA，并对其中的明星miRNA进行下一步验证，分析其可能的靶基因以及涉及的信号通路，从而探索rAAV的机理，为基因治疗的突破打开一扇门。

【关键词】：重组腺相关病毒 microRNA 基因表达效率 基因治疗
【学位授予单位】：华侨大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R450;Q78
【目录】：