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《华侨大学》 2015年
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缺铁胁迫下柑橘菌根共生体酚类物质及其关键基因研究

李建福  
【摘要】:丛枝菌根(Arbuscular Mycorrhizal,AM)真菌是一种古老的球囊菌门真菌,能与70%-90%的陆生植物形成互惠共生体,促进宿主植物对水分和矿质营养的吸收,显著改善植物的营养状况,明显增强植物的抗逆境能力。柑橘根系短、根毛稀少、甚至不生根毛,根系无法接触根际以外大部分的土壤,这成为根系吸收矿质营养的重要限制因子,因此,柑橘很大程度上依赖AM真菌得以维持柑橘的正常的营养水平。柑橘是一类对缺铁(Fe)非常敏感的果树,生产上由于土壤环境等因素频频出现缺Fe现象。柑橘缺Fe可以提高酚类物质的含量,促进Fe的运输。然而,缺Fe胁迫下,AM真菌诱导的酚类物质与Fe营养之间的关系未曾报道。本论文是在缺Fe胁迫条件下,以枳和红橘为供试植株,接种AM真菌地表球囊霉Glomus versiforme(G.versiforme),探讨AM真菌对枳(Poncirus trifoliata L.)和红橘(Citrus reticulate Blanco)根系酚类物质积累与分泌、酚类物质合成关键基因pal1表达的影响;克隆pal1基因及生物信息学分析,以期为AM真菌在柑橘上的利用和柑橘转基因工程育种提供一定的理论依据。本研究获得的主要结果如下:1.以G.versiforme为供试菌剂接种于枳和红橘幼苗上进行盆栽沙培试验,比较枳和红橘根系菌根侵染状况。结果表明,缺Fe和正常供Fe处理组的枳根系侵染率分别为29.0%和37.5%,菌丝密度分别为2.2±0.3 m·g-1和1.6±0.1m·g-1;缺Fe和正常供Fe处理组的红橘根系侵染率分别为39.5%和41.2%,根际菌丝密度分别为4.1±0.4 m·g-1和3.6±0.1 m·g-1。2.接种G.versiforme显著促进了枳和红橘植株的生长发育。在正常供Fe条件下,接种处理组枳和红橘植株地上部分生物量、地下部分生物量及总生物量分别为0.58±0.05 g DW/株、0.25±0.04 g DW/株、0.83±0.08 g DW/株和1.18±0.02g DW/株、0.55±0.03 g DW/株、1.73±0.08 g DW/株;在缺Fe条件下,接种处理组枳和红橘植株地上部分生物量、地下部分生物量及总生物量分别为0.37±0.01 g DW/株、0.21±0.05 g DW/株、0.58±0.03 g DW/株和1.03±0.01 g DW/株、0.47±0.05g DW/株、1.50±0.03 g DW/株,均显著高于对照组。3.接种G.versiforme显著提高了枳和红橘植株根系高铁还原酶(FCR)和苯丙氨酸解氨酶(pal)的活性。在正常供fe条件下,枳根系接种处理组fcr和pal的活性分别为10.47μmol·g-1h-1和120.80u·g-1fw,较未接种的分别提高了109.0%和20.8%;红橘根系接种处理组fcr和pal的活性分别为10.32μmol·g-1h-1和167.40u·g-1fw,较未接种的分别提高了84.0%和35.4%。在缺fe条件下,枳根系接种处理组fcr和pal的活性分别为17.63μmol·g-1h-1和138.0u·g-1fw,较未接种的分别提高了132.0%和27.3%;红橘根系接种处理组fcr和pal的活性分别为11.32μmol·g-1h-1和296.80u·g-1fw,较未接种的分别提高了52.0%和106.9%。4.接种g.versiforme显著增加了枳和红橘植株根系分泌物总酚的含量。在正常供fe条件下,枳和红橘根系接种处理组的总酚含量较未接种的分别提高了49.3%和91.8%;在缺fe条件下,枳和红橘根系接种处理组的总酚含量较未接种的分别提高了44.1%和44.0%。5.接种g.versiforme对枳和红橘植株根系分泌物酚类物质组分和含量均有一定的影响,但影响程度存在差异。接种g.versiforme的枳根系分泌物中咖啡酸、绿原酸、肉桂酸、香豆酸、没食子酸、原儿茶酸和丁香酸的含量,较未接种增加了3.75倍、0.33倍、0.67倍、0.33倍、0.5倍、0.71倍和0.43倍,但是,根皮素和水杨酸未检测出来;接种g.versiforme的红橘根系分泌物中香豆酸、阿魏酸、根皮苷、水杨酸、丁香酸和香草醛的含量,较未接种增加了1.4倍、0.67倍、0.67倍、2.44倍、0.71倍和1.0倍,但是,咖啡酸、肉桂酸、根皮素和香草醛未检测出来。6.接种g.versiforme显著促进了枳和红橘植株根系分泌物酚类物质对细胞壁fe的解吸。fe的解吸动力学实验表明,根系分泌物中酚类物质能有效释放固定在细胞壁上的fe,直接介导了根系质外体fe的再利用,在改善柑橘fe营养具有重要作用。7.柑橘根系的pal1基因的克隆及生物信息学分析。利用同源克隆法分别扩增了枳和红橘的pal1基因的cdna序列。对测序获得的序列分析,枳和红橘的cdna序列长度均为2166bp,其genbank登录号为kf753802和kp742840,包含一个完整的阅读框,编码721个氨基酸。预测枳和红橘的pal1的理论等电点、相对分子量、分子式分别为6.16、78449.3da、c3449h5520n970o1061s28和6.09、78590.4da、c3463h5523n969o1062s27。对推导氨基酸进一步多重比对分析发现,柑橘pal1蛋白序列含有典型的苯丙氨酸/组氨酸解氨酶蛋白标签以及与其他植物一致的典型的保守脱氨基位点和保守的催化活性位点。SignalP 4.1分析表明,pal1基因序列不含信号肽,该蛋白不属于细胞外分泌蛋白。对pal1基因推导的氨基酸序列进行疏水性分析表明,枳和红橘氨基酸疏水性位点相同,疏水性最大值为2.411(第524位氨基酸),最小值为-2.656(第353位氨基酸)。对pal1蛋白进行磷酸化位点分析表明,枳pal1蛋白有22个Ser,9个Thr,6个Tyr可能成为蛋白激酶磷酸化位点;红橘pal1蛋白有20个Ser,9个Thr,6个Tyr可能成为蛋白激酶磷酸化位点。蛋白质的二级预测表明,枳pal1蛋白含有α-螺旋49.51%,无规则卷曲28.57%,延伸链11.79%和?-折叠10.12%;红橘pal1蛋白含有α-螺旋48.13%,无规则卷曲28.99%,延伸链13.04%和?-折叠9.85%。以欧芹的PAL蛋白为模型,利用SWISS-MODEL对柑橘pal1蛋白进行3D结构分析。系统进化树分析表明,枳和红橘的pal与芸香科pal聚为一类。8.接种G.versiforme显著上调了枳和红橘植株根系pal1基因的表达。在正常供Fe条件下,接种处理组枳和红橘根系pal1的相对表达量分别为1.63和2.02,较未接种增加了63.0%和102.0%;在缺Fe条件下,接种处理组枳和红橘根系pal1的相对表达量为1.88和2.57,较未接种增加了52.3%和51.9%。
【关键词】:柑橘 丛枝菌根真菌 酚类物质 缺铁胁迫 克隆 苯丙氨酸解氨酶
【学位授予单位】:华侨大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S666;S182
【目录】:
  • 摘要3-6
  • Abstract6-13
  • 主要符号对照表13-14
  • 第1章 引言14-26
  • 1.1 柑橘的研究现状14
  • 1.2 丛枝菌根真菌研究现状14-18
  • 1.2.1 丛枝菌根的形成过程14-15
  • 1.2.2 丛枝菌根真菌对植物的影响15-18
  • 1.3 AM真菌-植物共生体酚类物质的研究现状18-22
  • 1.3.1 酚类物质的种类及生物合成18-19
  • 1.3.2 酚类物质的活性19-20
  • 1.3.3 酚类物质的检测方法20-21
  • 1.3.4 AM共生体酚类物质的产生及其作用机制21-22
  • 1.4 根系分泌物研究现状22-23
  • 1.5 本研究的内容、目的和意义23-26
  • 1.5.1 课题研究的内容23-24
  • 1.5.2 课题研究的目的与意义24-25
  • 1.5.3 技术路线25
  • 1.5.4 拟解决的问题25-26
  • 第2章 缺铁胁迫下丛枝菌根真菌对柑橘生长的影响26-42
  • 2.1 材料与方法26-30
  • 2.1.1 试验材料26-27
  • 2.1.2 试验设计27
  • 2.1.3 试验方法27-29
  • 2.1.4 数据分析29-30
  • 2.2 结果与分析30-38
  • 2.2.1 AM真菌对柑橘根系侵染及生物量的影响30-32
  • 2.2.2 AM真菌对柑橘根系FCR和PAL活性的影响32
  • 2.2.3 AM真菌对柑橘根系分泌物酚类物质含量的影响32-38
  • 2.2.4 AM真菌对柑橘细胞壁Fe解吸的影响38
  • 2.3 讨论38-42
  • 第3章 柑橘pal1基因的克隆42-64
  • 3.1 材料与方法42-49
  • 3.1.1 试验材料42
  • 3.1.2 试验设计42
  • 3.1.3 主要使用的实验仪器及试剂42-44
  • 3.1.4 主要培养基及缓冲液44
  • 3.1.5 试验方法44-49
  • 3.1.6 数据分析49
  • 3.2 结果与分析49-61
  • 3.2.1 柑橘根系中总RNA的提取及检验49
  • 3.2.2 柑橘pal1基因的克隆49-50
  • 3.2.3 柑橘pal1基因的生物信息学分析50-61
  • 3.3 讨论61-64
  • 第4章 缺铁胁迫下丛枝菌根真菌对柑橘酚类合成基因pal1表达的影响64-70
  • 4.1 材料与方法64-66
  • 4.1.1 试验材料64
  • 4.1.2 主要使用的实验仪器及试剂64
  • 4.1.3 试验设计64-65
  • 4.1.4 试验方法65-66
  • 4.1.5 数据分析66
  • 4.2 结果与分析66-68
  • 4.2.1 柑橘根系中总RNA的提取及检测66-67
  • 4.2.2 pal1基因的溶解曲线67-68
  • 4.2.3 pal1基因的表达分析68
  • 4.3 讨论68-70
  • 第5章 全文小结70-72
  • 5.1 主要研究结论70
  • 5.2 研究特色与创新之处70-72
  • 参考文献72-81
  • 致谢81-82
  • 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果82

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