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《华侨大学》 2018年
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害虫体内Cry结合蛋白的鉴定及其与Cry毒素的互作研究

温扬帆  
【摘要】:杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,Cry)是苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)最重要的杀虫活性成分。分离鉴定害虫体内可识别Cry毒素的结合蛋白,借以探究Cry杀虫作用的分子过程,从根本上寻求解决Cry发展受限困境的新思路和新线索,成为Bt研究的难点与热点。本研究利用Pull-down结合LC-MS/MS技术,从甜菜夜蛾血淋巴中分离鉴定出Cry1Ab1的非受体结合蛋白昆虫储存蛋白(Storage protein,SP)、Cry7Ab4的非受体结合蛋白β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)、微管蛋白(Tubulin)、延伸因子1-α(Elongation factor 1-alpha)、昆虫脱脂载脂蛋白(Apolipophorin)等。根据本实验室此前发现的新Cry基因——Cry2Ab12,构建并表达纯化Cry2Ab12毒素。同样利用Pull-down结合LC-MS/MS技术,从小菜蛾中肠液中分离鉴定出Cry7Ab4的非受体结合蛋白富蛋氨酸储存蛋白(Methionine-rich storage protien)、昆虫脱脂载脂蛋白、脂肪酶1(Lipase-1)、热休克蛋白70(Heat shock protein 70)等,以及Cry2Ab12的非受体结合蛋白芳基储存蛋白(Arylphorin)、富蛋氨酸储存蛋白、昆虫脱脂载脂蛋白、一类过氧化物酶(peroxiredoxin)等,并对这些结合蛋白与Cry杀小菜蛾的相关性进行了探讨。本研究在大肠杆菌中表达了甜菜夜蛾储存蛋白(SeSP),随后解析了Cry1Ab1与SeSP之间的互作界面,探讨了SeSP在Cry1Ab1杀甜菜夜蛾过程中的作用:(1)Cry1Ab1结合在SeSP六聚体结合位点,令其无法形成六聚体,因此无法在血淋巴中稳定存在,影响昆虫体内对营养物质的储存,进而对昆虫表皮形成、发育变态都将产生不可逆负作用,最终导致虫体死亡;(2)Cry1Ab1与SeSP的三个结构域均有结合,因此,二者的结合使SeSP无法发挥作用,降低了甜菜夜蛾体内酚氧化酶的活性,从而起到杀虫效果。此外,本研究还探讨了β-1,3-葡聚糖酶和脱脂载脂蛋白等非受体结合蛋白与Cry7Ab4杀甜菜夜蛾作用的相关性。最后,本研究提出了血淋巴结合蛋白介导的Cry杀鳞翅目害虫作用假说模型。本实验室前期利用Pull-down结合LC-MS/MS技术,已从小菜蛾和甜菜夜蛾中肠液中,分别鉴定出Cry1Ab1的非受体结合蛋白Dorsal和POXC。本研究以纯化了的Dorsal与Cry1Ab1为对象,采用生物膜层干涉技术,对二者之间的互作进行了定性和定量研究,发现二者以1:1发生着较强结合,其KD值为3.96×10~(-9)M。经分子对接分析,解析了二者互作的界面,据此合成了6条短肽,采用生物膜层干涉技术考察其互作,证实其中2条短肽可与小菜蛾Dorsal发生结合:NFDGSFRGSAQG、NSSVSII与Dorsal之间互作的KD值分别为8.68×10~-55 M和2.64×10~(-5)M,为Cry1Ab1与Dorsal结合过程中的关键肽段。这两个肽段对应在Dorsal蛋白上的结合区域为51-87,该区域对应的是参与修饰和核酸定位的p50Domain I,将影响Dorsal与特异κB序列进行结合,进而影响AMP转录水平。此外,本研究还考察了Cry1Ab1与POXC的定性互作,二者以1:1发生互作。综上所述,本研究分离鉴定了甜菜夜蛾血淋巴中的Cry1Ab1结合蛋白和Cry7Ab4结合蛋白,表达了Cry1Ab1血淋巴结合蛋白SeSP,考察了Cry与结合蛋白的体外互作,解析了Cry与结合蛋白的互作界面,鉴定了互作界面的关键肽段。这些研究结果,为揭开Cry杀虫过程的全貌提供了新的思路和线索,为应对抗性发展和提高杀虫活性提供理论基础。
【学位授予单位】:华侨大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S476

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