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《华侨大学》 2018年
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基于微流控技术的大多孔高分子微球用于模块化组织工程的研究

赵佳  
【摘要】:近年来,先天性缺陷、创伤性损伤、手术切除或退化性肌病等造成的骨骼肌缺损和功能丧失,已成为医疗领域常见的病例。组织工程的发展为骨骼肌缺损修复提供了全新的治疗思路。骨骼肌组织工程要求为病变或缺损部位提供足够数量且具有适当表型的细胞。多孔微载体不仅能满足此要求,为细胞生长提供开放和相互贯通孔洞结构的三维环境;还可以复合细胞体外构建模块化微组织,并通过原位注射的方式修复组织缺损,避免了对患者的二次创伤。因此,本论文提出以聚乳酸羟基乙酸(PLGA)为原料,通过微流控技术制备可注射型PLGA大多孔微球(LPMs)微载体,并通过三维微重力手段负载细胞构建可注射型微组织。探讨其可行性,以期应用于模块化组织工程领域。首先,通过Minitab全因子实验设计方案,研究聚合物浓度、水油比以及制孔剂浓度等三个指标对微载体孔径和粒径的影响。结果表明聚合物浓度、致孔剂浓度对微载体粒径和孔径的影响显著;而水油比对微载体粒径和孔径的影响不显著。通过选择聚合物浓度为2.0%,明胶浓度7.5%时,改变水油比,可以同时获得具有较小粒径和较大孔径,且均一性较好的PLGA LPMs微载体材料。考察微流控过程中制备工艺参数对微载体形貌和结构的影响。结果表明微流控技术制备微载体过程,受到水-油界面张力和连续相流体剪切力的共同作用。通过改变针头尺寸、乳化功率和连续相/分散相流速比,可成功制备可注射型微载体。傅里叶红外光谱、热分析和X射线衍射结果表明,经过微流控处理后,制备的微载体与原材料相比,官能团、玻璃化转变温度和晶型均未发生明显变化。顶空气相色谱分析表明,微载体中有机溶剂二氯甲烷残留量小于1 ppm,符合组织工程材料要求。其次,对制备的微载体进行生物相容性评价。细胞毒性试验结果表明,PLGA微球混悬液对小鼠成肌细胞(C2C12)细胞无明显抑制作用,细胞形态良好,可正常增殖,增殖率均大于75%,毒性反应级别属于1级水平。血液相容性试验结果表明,随着微球混悬液浓度的提高,各受试组间差异不明显,溶血率均5%,表明PLGA LPMs具有良好的血液相容性。全身急性毒性试验结果表明,腹腔注射不同浓度微球混悬液后,各受试组小鼠临床症状正常,体重增加,且结合裸眼组织病理学观察和肝脏HE染色,说明PLGA LPMs无明显全身急性毒性作用。最后,进行成肌细胞(MCs)与PLGA LPMs复合体(球状微组织)的构建与表征。通过激光共聚焦显微镜定性分析静、动态培养方式下,对比分析PLGA LPMs微载体3、9、24、48 h后,C2C12细胞的黏附情况。通过血细胞计数板和CCK-8法定量分析细胞的黏附和生长情况。发现C2C12细胞在微载体上的黏附量和增殖均呈现递增的趋势,且动态方式优于静态方式。对构建的球状微组织进行基因特性表达分析,利用Real-time PCR定量分析球状微载体培养20 d后成肌相关基因的表达情况。结果显示MyoD1、Myf5及Pax7的表达相对较高,说明PLGA LPMs微载体具有较强的诱导肌向分化的能力以及优异的成肌性能。球状微组织HE染色实验结果表明,微组织肌纤维呈纤维状或多边形状紧密排列、形态规则,并且存在一定的细胞外基质。球状微组织免疫荧光实验结果表明,免疫荧光染色可见,经过分化诱导,MCs-PLGA球状微组织均可以表达肌纤维特异性蛋白MYHI与Desmin,呈现成熟多核骨骼肌组织的特性。说明MCs-PLGA球状微组织在体外已初步构建并成熟。综上所述,微流控技术制备的PLGA LPMs具有良好的生物相容性;且粒径在280-370μm间,孔径在15-75μm间。所构成的生物相容性三维基质有利于C2C12细胞的黏附、增殖和分化。并可在三维微重力培养条件下,体外构建模块化的可注射型成熟骨骼肌微组织。
【学位授予单位】:华侨大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R318

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