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《福州大学》 2004年
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大黄鱼生长激素基因的分析及其在大肠杆菌中的表达

陈莉  
【摘要】:为了解决目前大黄鱼(Pseudosciaena crocea,pc)等名贵经济鱼类在养殖 中存在的养殖周期长,饵料利用率低,养殖生产成本较高的问题,急需开发鱼类 本身的基因产物以改良鱼类养殖饲料。鱼类生长激素(growth hormone,GH)是 鱼类脑垂体细胞分泌的多肽激素,具有增强食欲、提高饲料转化率的作用。天然 鱼 GH 含量极低,分离纯化成本较高。基因工程技术为生产大量低成本的鱼生长 激素创造了条件,且实验证明重组鱼 GH 具有天然鱼 GH 的功能,却不会对人体产 生激素副作用。因此,生产基因重组大黄鱼 GH 在养殖领域具有重要的应用价值。 本论文分析了最新克隆的 pcGH 基因的特征,成功实现了 pcGH 在大肠杆菌中 的胞内表达和周质表达,并进一步探讨了影响 pcGH 在大肠杆菌中表达水平的各 种因素。 通过与数据库中同类蛋白序列的比较,发现最新克隆的 pcGH 分别在不同位 置与数据库中的 pcGH 及黑斑红鲈(Sciaenops ocellata)GH 有高度同源性,推 断这个 pcGH 基因来源于多个近源鱼种的杂交体。这一发现将有助于进一步研究 分析鱼类 GH 的活性部位及其突变对鱼类生长的影响。 通过 PCR 引物设计,在 pcGH 基因两端引入两个酶切位点,将其插入到大肠 杆菌表达载体 pET-22b(+)中,构建胞内表达质粒 pG2。将 pG2 转化大肠杆菌 BL21(DE3)和 Rosetta(DE3)。SDS-PAGE 分析发现,pG2/Rosetta(DE3)在诱导后对 应于 pcGH 分子量的位置有特异蛋白带随时间增浓,但在 pG2/BL21(DE3)中该位 置蛋白带浓度变化不明显。说明了 Rosetta(DE3)菌株有助于改善 pcGH 中大肠杆 菌稀有密码子对表达水平的影响。pcGH2/Roseta(DE3)的表达产物为可溶性蛋白; 该产物用硫酸铵分级沉降和阳离子交换层析分离纯化,达到电泳纯。 通过酶切位点的选择,使 pcGH 基因插入 pET-22b(+)载体上 pel B 分泌肽编 码序列的下游,构建成功周质表达质粒 pG3;将 pG3 转化大肠杆菌 Rosetta(DE3), 诱导表达后分离周质蛋白,发现部分重组蛋白在周质中表达。 本文还从转录水平和翻译水平系统、完整地探讨了影响 pcGH 在大肠杆菌中 表达水平的各种可能因素,分析了进一步提高重组大黄鱼 GH 的产量的可能方法。 这些工作对重组 pcGH 的生产和应用具有指导意义。
【学位授予单位】:福州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S917

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【参考文献】
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