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《福建农林大学》 2011年
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柑橘试管苗种质保存及其microRNA鉴定

陈晓东  
【摘要】:柑橘是热带、亚热带最重要的果树之一,具有重要的经济价值。随着科技的发展,人们越来越认识到种质资源保存的重要性。离体种质保存成为柑桔种质保存的有效手段而受到国内外的重视。本试验主要开展如下研究:①以芦柑珠心胚试管苗为材料,进行了离体保存体系的优化;②67份柑橘种质珠心胚试管苗的离体保存;③柑桔试管苗叶片GPX基因的克隆;④柑桔离体保存试管苗叶片microRNA的分离与鉴定,旨在保存柑桔种质资源,并为研究其离体保存分子机制奠定基础。主要研究结果如下: 1.芦柑试管苗保存体系的优化 以初代培养一个月的芦柑试管苗为主试材料,将其茎段切成1.5-2 cm,每一段包括一个健壮的节,采用L9(34)正交设计实验,探讨基本培养基、多效唑浓度和甘露醇浓度对芦柑试管苗保存的影响,筛选出最佳培养基。结果表明:1/2MS+1.0 mg·L~(-1)多效唑+1.0 g·L~(-1)甘露醇最有利于芦柑试管苗的保存,其次为1/4MS+1.0 mg·L~(-1)多效唑+5.0 g·L~(-1)甘露醇,而MS+1.0 mg·L~(-1)多效唑+10 g·L~(-1)甘露醇最不利于芦柑试管苗的保存。在探讨的这三个因素中,甘露醇浓度对芦柑试管苗保存的影响程度最大,而多效唑和基本培养基则效果相当。当甘露醇浓度为10 g·L~(-1)时对芦柑试管苗保存不利,而多效唑浓度为1.0 mg·L~(-1)时则有利于其保存,适当的营养饥饿有利于保存。 2. 67份柑桔种质资源的试管苗离体保存 本研究在继续保存原有43份柑橘种质资源的同时,新增资源24份,分别为红桔、柠檬橙(平顶)、柠檬橙(凸顶)、立花桔、琼中绿橙、本地早、芦芝柚、四季柚、早3号、野生桔、血橙、脐橙、金弹1、金弹2、金弹3、滑皮金柑、金柑35B、金柑58B、金柑59、金柑59B、金柑72B、金柑80B、金柑101B和金柑105。在接种一个月后对新增加的24份资源中的18份的生长情况进行了观察,结果发现除金弹1和滑皮金柑外,其它柑橘徒长严重,且顶端优势明显;立花桔、柠檬橙、台湾红桔等10份资源叶片充分展开,其它8份资源叶片未充分展开,叶片大小差异较大;根均生长健壮,但长度各异,差异较大。 3芦柑试管苗GPX基因的克隆 以芦柑试管苗的叶片为材料,采用改良的Trizol法提取总RNA,采用同源克隆的方法对芦柑试管苗GPX基因进行克隆。保守区引物直接采用陈义挺(2009)在龙眼上设计的GPX保守区引物,通过RT-PCR扩增出保守区序列,长度为387 bp(包含上下游引物),与已登录NCBI的多种植物的GPX基因同源性较高,其中与蓖麻的同源性最高,达86%;根据已经获得的GPX基因保守区序列设计3’RACE引物,经过两轮巢氏PCR扩增,得到3’端序列,长度为500 bp;采用DNAMAN 6.0软件将得到的保守区和3’端的序列进行拼接,得到一条599 bp长的片段。已在GenBank上登录,登录号为:GU130596.1。 4利用Solexa测序技术鉴定柑橘试管苗叶片中的miRNAs 本研究第一次对柑橘试管苗叶片进行小RNA文库构建和Solexa测序。以芦柑试管苗叶片发育过程中的三个时期的叶片为材料,提取小分子RNA,将其均匀混合,进行小RNA文库构建和Solexa测序。研究结果表明:共得到Unique序列3,065,625条,其中miRNA占0.68%;10.44%的Unique序列能在柑橘基因组中找到匹配位点;柑橘sRNA以24 nt的长度作为主要存在方式;柑橘试管苗叶片发育过程中Unique sRNA的表达丰度存在巨大差异,从一次到数万次不等,其中大部分为低丰度表达;总共鉴定了302个已知的柑橘miRNA,构成117个家族,不同家族间成员数量存在巨大差异;保守miRNA长度集中在21 nt;双子叶植物特有的miR163在本研究中未检测到,而被认为是单子叶植物所特有的miRNA437/ 444/528/1122/1126/1132在本研究中得到发现;另外总共获得76个候选的miRNA,其中有28个miRNA含单个基因座,另48个miRNA具备多个基因座;76个候选miRNA中有72个预测到了靶基因,总共对应着约153个基因符合靶标特征。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S666

【引证文献】
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【同被引文献】
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