苯丙氨酸解氨酶基因遗传转化水稻的研究

【摘要】：苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine Ammonia-lyase,PAL)是苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶,也是类黄酮生物合成途径的限速酶,它的活性与黄酮类化合物的形成呈正相关。黄酮类化合物具有抗肿瘤、防癌抗癌、抗心血管疾病、抗氧化和延缓衰老、免疫调节、抗糖血病等重要的药理作用,人体不能合成黄酮类化合物,主要从食物中摄取。 本研究采用基因工程技术,从本实验室筛选出的黄酮类物质含量特高水稻优异种质“M-1”中克隆的PAL基因,通过农杆菌介导法导入到其它类黄酮含量低稻谷产量高的水稻中,使其在胚乳特异表达,期望选育出稻谷产量高且类黄酮含量高的水稻新品系。主要的研究结果如下: 1、植物表达载体PCDMAR-PAL-Hyg的构建:构建了含有PAL基因的双T-DNA植物表达载体的构建PCDMAR-PAL-Hyg,该载体含有两段相互独立的T-DNA区域,其中一个T-DNA区域含有目的基因PAL,另外一个T-DNA区域含有标记基因Hyg。该植物表达载体选用胚乳特异表达启动子Gt1,驱动PAL基因的表达,在PAL基因的两侧连接的两段正向重复Rb7MARs序列能增强PAL基因的表达。 2、无Hyg标记的转基因水稻的获得:采用农杆菌介导的方法,将植物高效表达载体PCDMAR-PAL-Hyg导入到水稻品种“TG-9”、“527”、“MH86”中,获得“TG-9”转基因植株153株,经PCR筛选27株呈阳性;获得“527”转基因植株7株,经PCR筛选3株呈阳性;获得“MH86”转基因植株4株,经PCR筛选1株呈阳性。对转基因阳性植株单酶切基因组DNA进行Southern杂交,结果表明目的基因已整合到水稻基因组中,但不同的转基因植株中目的基因有不同的插入位点和拷贝数。对“TG-9”T_1代植株进行PCR鉴定,成功筛选出了含有PAL基因而无Hyg标记的转基因水稻。 3、利用紫外-可见分光光度计,测定了“TG-9”T_0代阳性转基因稻米中总黄酮的含量。与对照植株的总黄酮含量相比,有26株的转基因植株的总黄酮含量有明显的提高,其中总黄酮含量最高提高83.3%,最低提高7.05%,均达到了极显著水平。