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抗菌蛋白、硫堇蛋白等辣椒PR基因转化水稻及其抗稻瘟病初步分析

陈华观  
【摘要】:水稻作为我国最主要的粮食作物之一,是我国粮食安全和农业可持续发展的重要战略资源。长期以来,稻瘟病、纹枯病、白叶枯病等真菌性或者细菌性病害严重限制了水稻的产量和品质。通过基因工程克隆抗病基因并与常规育种技术相结合培育抗病新品种是现代作物遗传改良的有效途径。本研究拟从辣椒中分离出的广谱抗病基因(抗菌蛋白、硫素蛋白、亲环蛋白、铁氧还蛋白、非特异性脂转移蛋白)与强诱导型启动子LURP1(Late Upregulated in Response to Hyaloperonospora parasitica)结合起来转化水稻日本晴,获得转基因植株,并进行稻瘟病的初步抗性分析,从中筛选具有较强抗稻瘟病的转基因新品种,为实现水稻抗病与高产的有机统一打下一定的基础。主要结果如下: 1、利用Gateway克隆技术构建了CaAPs(抗菌蛋白)、CaThs(硫堇蛋白)、CaCyPs(亲环蛋白),CaFds(铁氧还蛋白)、CansLTPs(非特异性脂转移蛋白)的植物表达载体,并进行测序验证,结果表明上述5个辣椒PRs基因已成功构建到pMDC-32植物表达载体中,且目标基因序列与原序列完全一致; 2、以日本晴成熟种子为材料,通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法,将上述5个辣椒PRs基因转化粳稻品种日本晴中,并初步统计其转化率以及阳性率。结果表明,成熟日本晴种子的愈伤诱导率大约在80%—90%之间,转化率大约在9%-15%,其中CaAPs筛选开始时的愈伤数约为263个,分化苗数为31株,转化率约11.79%;CaThs筛选开始时的愈伤数约为235个,分化苗数为25株,转化率约为10.64%;CaCyPs筛选开始时的愈伤数约为187个,分化苗数为17株,转化率约为9.09%;CaFds筛选开始时的愈伤数约为206个,分化苗数为23株,转化率约为11.17%;CansLTPs筛选开始时的愈伤数约为157个,分化苗数为17株,转化率约为10.83%。提取水稻基因组DNA,进行PCR验证,计算转基因水稻的阳性率,其中,获得CaAPs阳性植株30株,阳性率约为96.77%;获得CaThs阳性植株株25株,阳性率约为100%,获得CaCyPs阳性植株17株,阳性率约为100%,获得CaFds阳性植株23株,阳性率约为100%;获得CansLTPs阳性植株15株,阳性率约为88.24%。由于栽培管理以及病菌侵染等因素,部分转基因苗死亡。最后,将28株CaAPs阳性植株,23株CaThs阳性植株,15株CaCyPs阳性植株,20株CaFds阳性植株,15株CansLTPs阳性植株移栽大田,收获T_1代种子; 3、对上述T_1代转基因植株进行稻瘟菌guy1的接种处理,通过RT-PCR分析上述CaAPs,CaThs,CansLTPs基因在水稻中的表达情况,并进行转基因植株的表型分析及抗性鉴定。RT-PCR结果分析发现,外源抗CaAPs,CaThs,CansLTPs基因在稻瘟菌未接种和接种的条件下,都有不同程度的表达,但在接种后表达量都有所提高。与接种稻瘟菌的野生型日本晴植株相比,外源CaAPs,CaThs,CansLTPs基因这三个转基因水稻的发病程度明显较轻,表明对稻瘟病的抗性有不同程度的提高。这些结果表明,辣椒外源防卫反应基因转化水稻日本晴在一定程度上提高了水稻对稻瘟菌的抗病性,此外。又进一步验证了前人的研究结果:不同高等植物里含有一套相似的防卫反应基因。 4、拟南芥LURP_1启动子在水稻中的表达分析发现,在双子叶模式植物拟南荠抗病中起重要调节作用的LURP_1启动子同样可以在水稻中诱导抗性基因的表达,这说明单子叶和双子叶植物中顺式作用元件在激活植物防御反应方面存在着一定的保守性。


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