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《福建农林大学》 2011年
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植物抗病防卫相关基因的克隆及其转化烟草的研究

张艳  
【摘要】:病害是制约农作物高产、稳产的重要因素,药物防治对环境污染严重且投入大、效果差。因此培育抗病品种成为一项重要课题。传统的新品种培育方法周期长且后代遗传稳定性差。在生物技术特别是基因工程的推动下,对植物抗病性的研究越来越深入。通过将抗病基因、信号传导/调控基因、抗菌蛋白基因转入植物,来提高植物的抗病性,利用抗病基因工程培育出的抗病新品种不仅培育周期短,而且能够较稳定地遗传。 RAR1、SGT1是植物抗病性反应信号传导途径中的调控基因,是植物防卫反应信号的重要组件。它们不仅参与R基因介导的抗病性的调控,还可能参与非宿主抗性即广谱抗性反应的调控。 为了更进一步地了解它们的功能、培育植物抗病品种,本研究从烟草中克隆到这两个基因,分别构建了二者的超表达载体和RNAi干扰载体并进行烟草的遗传转化,获得转基因烟草阳性植株并初步分析了二者在转基因植株中的表达量变化,为进一步研究二者在烟草的抗病性中的作用和培育烟草抗病品种奠定基础。 本研究结果如下: 1. NbRAR1超表达载体和RNAi干扰载体的构建 根据GenBank上已公布RAR1序列设计引物,构建NbRAR1的克隆载体。利用双酶切技术经目的条带扩增与回收、载体与目的片段的双酶切及二者的连接反应获得NbRAR1超表达载体;同样的方法,分别将NbRAR1的正向干扰片段和反向干扰片段同干扰载体连接,从而获得NbRAR1的RNAi干扰载体。NbRAR1超表达载体和RNAi干扰载体分别经PCR和双酶切验证,两种方法均获得预期结果,表明载体构建成功。 2. NbSGT1超表达载体和RNAi干扰载体的构建 根据GenBank上已公布SGT1序列设计引物,构建NbSGT1的克隆载体。经目的条带扩增与回收、载体与目的片段的双酶切及二者的连接反应获得NbSGT1超表达载体;同理,分别将NbSGT1的正向干扰片段和反向干扰片段同干扰载体连接,获得NbSGT1的RNAi干扰载体。二者经PCR和双酶切验证,获得预期结果,载体构建成功。 3.烟草的遗传转化 以烟草K326品种为实验材料,建立烟草叶盘法再生体系。本研究以烟草无菌苗叶片作为外植体,用含目的基因的农杆菌浸染经预培养的烟草外植体,共培养两三天后,转入筛选培养基筛选,再转入分化培养基进化分化,最后转入生根培养基进行生根培养。其中叶片分化率如下:转NbRAR1ox的为68%,转NbiRAR1的为70%,转NbSGT1ox的为58%,转NbiSGT1的为66%。 4.转基因烟草植株检测及RT-PCR分析 利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,成功获得了转基因烟草植株,转NbRAR1ox、NbiRAR1、NbSGT1ox、NbiSGT1的转基因植株数分别为32,38,15,26株。并采用了两种方法对转基因烟草植株进行检测分析:一是PCR鉴定,这里对潮霉素抗性基因和目的基因都进行了检测,其中对潮霉素抗性基因检测结果为:转NbRAR1ox基因转基因烟草苗的阳性率为91%,NbiRAR1转基因烟草植株阳性率为92%,NbSGT1ox转基因植株的阳性率为87%,NbiSGT1转基因植株阳性率为73%;对目的基因检测的结果为:转NbRAR1ox、NbiRAR1、NbSGT1ox、NbiSGT1的转基因植株的阳性率分别为88%,89%,73%,78%。获得的阳性植株分别为:28、34、11、20株。二是组织化学水平的GUS染色。本研究随机选取经PCR检测为阳性的转基因植株进行实验,经染色与对照相比,结果表现蓝色,为阳性反应。该结果表明GUS基因已整合到再生烟草植株的基因组并已表达,此结果说明,得到的再生植株为转基因植物株。此外,对阳性转基因烟草植株进行了RT-PCR分析,经以上两种方法检测均为阳性的转基因烟草植株,随机选取三株进行RT-PCR分析,结果表明,NbRAR1与NbSGT1基因过表达转基因植株均有一定的过量表达,二者的干扰转基因植株则有较为明显的干扰效果,植株之间表达差异较大。
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