龙眼体胚发生过程中若干PCD相关基因的克隆及表达

【摘要】：本研究以龙眼(Dimocarpus longan Lour.)“红核子”胚性愈伤组织(Embryogenic callus, EC)为材料,对以下3个方面进行研究:①龙眼体胚发生过程中PCD相关基因CP、COX Vb、Caspase的cDNA克隆;②龙眼体胚发生过程中PCD相关基因CP、COX Vb、Caspase的生物信息学分析;③龙眼CP、COX Vb、Caspase在体胚发生过程中的定量表达;主要研究结果如下: 1.龙眼体胚发生过程中PCD相关基因CP、COX Vb、Caspase cDNA全长的获得 以龙眼EC为材料,应用同源克隆结合RACE技术,获得了龙眼体胚发生过程中PCD相关基因CP、COX Vb、Caspase cDNA的全长: ①龙眼CP的cDNA全长为823bp,其中5'UTR为163bp,3'UTR为258bp,3’端还含有1个20 bp的poly(A)尾。该序列与登录GenBank的其它植物CP基因有很高的同源性。序列分析发现拼接的cDNA含有一个411bp的开放阅读框,编码136个氨基酸,ATG为起始密码子、TAA为终止密码子。将此基因命名为DLCP,并在GenBank上登录,登录号为JF733788。 ②龙眼COXVb的cDNA全长为627bp,5'UTR为140bp,3'UTR为66bp,区域还含有典型的15bp的poly(A)尾。序列分析发现拼接的cDNA龙眼COX Vb开放阅读框((ORF)共有420个碱基组成,编码139个氨基酸,TAG为终止密码子。将此基因命名为DLCOXVb,并在GenBank上登录,登录号为JF733786。 ③龙眼Caspase cDNA全长为868bp,5'UTR为73bp,3'UTR为272bp,无典型polyA尾巴。根据DNAMAN6.0软件分析龙眼Caspase开放阅读框((ORF)共有519个碱基组成,编码173个氨基酸,TGA为终止密码子。将此基因命名为DLCPS-1,并在GenBank上登录,登录号为JF733787。 2.龙眼体胚发生过程中PCD相关基因CP、COX Vb、Caspase的生物信息学分析 应用生物信息学软件对龙眼胚性愈伤组织CP、COXVb、Caspase的开放阅读框编码的氨基酸序列进行了预测和分析。结果表明: ①CP蛋白分子式是:C623H948N174O200S17;分子量是14620.4 Da;理论等电点pI 6.76;是具跨膜结构域的亲水性胞质蛋白,没有信号肽,由4.41%的β折叠和95.59%的不规则卷曲组成,通过功能的预测与分析,推测与细胞的死亡有关系。此外,还对CP酶分子三维立体结构等进行了预测和分析。 ②COXVb蛋白的分子量是15229.6Da;理论等电点pI 7.02;没有跨膜结构域的亲水性胞质蛋白;具有信号肽;由29.29%的α螺旋,12.14%的β折叠和58.57%的不规则卷曲组成;可能的磷酸化位点有12个;通过功能的预测与分析,推测龙眼COXVb参与PCD调控。此外,还对其三维立体结构等进行了预测和分析。 ③Caspase蛋白的分子量是19502.2 Da;理论等电点pI值为9.32;该蛋白不具有信号肽序列,是具跨膜结构域的亲水性蛋白;二级结构由17.06%的α螺旋、12.35%的β折叠和70.59%的不规则卷曲组成;有6个磷酸化位点。通过功能的预测与分析,推测与细胞的凋亡有关。 3.龙眼CP、COX Vb、Caspase在体胚发生过程中的定量表达 在获得龙眼体胚发生过程中不同阶段胚性同步化培养物的基础上,提取龙眼总RNA,并按荧光定量PCR要求进行逆转录,作为检测样本。根据已获得的CP、COXVb和Caspase cDNA全长,设计龙眼CP、COXVb和Caspase基因序列的荧光定量引物。以EF-1α和UB 2个基因作为内参基因,通过荧光定量分析这3个基因在样品中的表达情况,结果如下: ①CP在胚性愈伤II表达量相对较高,从胚性紧实球形结构到球形胚阶段变化起伏不大,在心形胚结构阶段表达量急剧上升,说明在胚胎早期已开始了与胚胎发育有关的代谢程序。之后又逐步下降,在成熟子叶形胚中的表达量最低。CP的相对表达量与细胞分化相关,龙眼CP的表达量与细胞分化程度成正比。 ②在龙眼体胚发生过程中,从胚性愈伤组织到球形胚阶段COXVb基因表达量较为恒定。从球形胚到心形胚变化是最剧烈的,在心形胚阶段表达量迅速升高,可能预示着新的发育状态来临。之后又逐渐下降,与先前的表达水平几乎一致。在成熟子叶胚阶段COXVb表达量达到最高。COXVb表达量与细胞内代谢能力成正比关系, COXVb的表达能够维持线粒体功能的完整性,为活跃的代谢活动提供能量,在促进体胚的正常发育起重要的作用。 ③在龙眼体胚发育早期,Caspase的表达水平较高。从胚性愈伤II到不完全胚性紧实结构,表达量逐步升高,而在不完全球形结构到球形结构过程中,表达量降低。在心形胚阶段,Caspase基因表达量增加,达到表达量的最高峰,可能与细胞程序性死亡相关。之后又逐渐下降,在成熟子叶胚阶段表达量最低。龙眼Caspase在细胞程序性死亡过程中发挥作用。 总之,本研究克隆了与体胚发生过程中PCD有密切相关的3个基因,进行了表达分析,并比较全面地预测和分析了它们的结构和功能,加深了对龙眼体胚发生过程中PCD现象相关机制的理解,为在分子水平上进行龙眼以及其它植物胚胎发育调控等方面的遗传改良提供新的思路。