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《福建农林大学》 2011年
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荔枝果实成熟过程中的差异蛋白质组学研究

李开拓  
【摘要】:本研究以荔枝品种‘乌叶’(Litchi chinensis Sonn.cv.‘Wuye’)和‘下番枝’(Litchi chinensis Sonn.cv.‘Xiafanzhi’)果实为试验材料,利用双向电泳和质谱技术对荔枝果实不同成熟时期进行了差异蛋白质组学研究。获得了与荔枝果实成熟衰老相关的差异蛋白,并对部分差异蛋白进行cDNA克隆及相对定量表达分析。主要研究结果如下: 1.建立了适合荔枝果皮和假种皮中总蛋白质提取的方法和双向电泳体系。以荔枝果皮和假种皮为材料,比较了TCA-丙酮、丙酮和酚3种提取方法在总蛋白产量、单向SDS-PAGE和双向电泳等方面的区别,并对荔枝果皮和假种皮的双向电泳体系进行探索。结果表明,酚抽提法最佳,提取的总蛋白得率最高;所获蛋白在单向SDS-PAGE中形成条带数目最多,最清晰;经双向电泳分离用银染显色,2D图谱分辨率较好,蛋白点清晰,主要分布在pH4-8,15.0-85.0 kD,可有效解析荔枝果皮和假种皮的蛋白质组。 2.采用18 cm pH4-7和pH3-10 IPG胶条相结合的方法对‘乌叶’果皮不同成熟期进行蛋白质分离,随着果皮的成熟蛋白点数总体表现出先上升后下降的变化。其中,以阶段Ⅲ检测到的蛋白点数目最多,分别为753和937个,这个时期刚好处在荔枝果皮的转色期;以阶段Ⅵ完全转红期的蛋白点数最少,分别为651和604个。从pH4-7胶条分离的蛋白中选取79个和pH3-10胶条分离的蛋白中选取28个,总107个差异蛋白进行MALDI-TOF/TOF质谱分析,获得了107个完整的肽指纹图谱,61个差异蛋白获得成功鉴定,成功率约为57.0%。通过生物信息学分析,这些鉴定成功的已知蛋白参与了糖和能量代谢(29.51%)、蛋白质合成和代谢以及稳定(11.48%)、基因表达调控(11.48%)、抗氧化(9.84%)、细胞代谢和周期调控(4.92%)、氨基酸代谢(4.92%)、转录与翻译(4.92%)、信号转导(1.64%)等生命活动功能,功能未知的蛋白为21.31%。 3.采用18 cm pH4-7和pH3-10 IPG胶条相结合的方法对‘下番枝’果皮不同转色期进行蛋白质分离,随着果皮转色的进程蛋白点数表现出上升趋势。其中,以果皮转红阶段检测到的蛋白点数目最多,分别为750和1106个,在果皮为青色期的蛋白点最少,分别为643和1041个。从pH4-7胶条分离的蛋白中选取55个和pH3-10胶条分离的蛋白中选取10个,总65个差异蛋白进行MALDI-TOF/TOF质谱分析,获得了65个完整的肽指纹图谱,43个差异蛋白获得成功鉴定,成功率约为66.15%。通过生物信息学分析,这些鉴定成功的蛋白参与了糖和能量代谢(20.93%)、蛋白质合成和代谢以及稳定(16.28%)、基因表达调控(13.95%)、信号转导(6.98%)、氨基酸代谢(6.98%)、转录与翻译(6.98%)、次生代谢(4.65%)、抗氧化(4.65%)、细胞结构相关(2.33%)、激素相关(2.33%)等生命活动功能,功能未知的蛋白为13.95%。 4.采用18 cm pH4-7胶条对‘乌叶’假种皮不同成熟期进行蛋白质分离,随着果皮转色的进程蛋白点数表现出先上升再下降的变化趋势。其中,以阶段Ⅲ检测到的蛋白点数目最多1374个,这个时期刚好处在荔枝果实的转色期;以阶段Ⅵ果实完全转红期的蛋白点数最少914个;其它时期检测到的蛋白点为:阶段Ⅰ1144个、阶段Ⅱ1330个、阶段Ⅳ1096个、阶段Ⅴ1012个。这与乌叶果皮转色过程中蛋白质点数的总体变化趋势相似,在阶段Ⅲ能检测到的蛋白质最多,在阶段Ⅵ完全转红期的蛋白质最少。选取64个差异蛋白进行MALDI-TOF/TOF质谱分析,获得了64个完整的肽指纹图谱,43个差异蛋白获得成功鉴定,成功率约为67.19%。通过生物信息学分析,这些鉴定成功的蛋白参与了糖和能量代谢(27.91%)、蛋白质合成和代谢以及稳定(11.63%)、氨基酸代谢(6.98%)、细胞结构和周期调控(6.98%)、基因表达调控(4.65%)、转录与翻译(9.3%)、信号转导(4.65%)、抗氧化(4.65%)、次生代谢(4.65%)等生命活动功能,功能未知的蛋白为18.6%。 5.荔枝果实成熟过程中部分相关蛋白的基因克隆及其在果皮中的表达。 ①克隆了荔枝果皮Actin1基因的cDNA序列,该序列全长1418 bp,其中开放阅读框(ORF)共有1134 bp,编码377个氨基酸。Actin1在荔枝果皮不同成熟期的蛋白水平和转录水平的表达相对稳定,变化不大。因此,在研究荧光定量表达分析中,所克隆的Actin1基因可作为其它目的基因的内参基因。 ②克隆了荔枝果皮UFGT基因的cDNA序列,该序列全长1577 bp,其中开放阅读框(ORF)共有1362 bp,编码453个氨基酸。荔枝果皮UFGT基因在转录水平随着果皮着色的加深呈不断上升变化,与其在果皮成熟过程中的蛋白水平表达趋势一致。 ③克隆了荔枝果皮OEE1基因的cDNA序列,该序列全长1217 bp,其中开放阅读框(ORF)共有1002 bp,编码333个氨基酸。荔枝果皮OEE1基因在转录水平随着果皮着色的加深呈不断下降变化,与其在果皮成熟过程中的蛋白水平表达趋势一致。 ④克隆了荔枝果皮rbcs基因的cDNA序列,该序列全长868 bp,其中开放阅读框(ORF)共有567 bp,编码188个氨基酸。荔枝果皮rbcs基因在转录水平随着果皮着色的加深呈不断下降变化,与其在果皮成熟过程中的蛋白水平表达趋势一致。 ⑤克隆了荔枝果皮Aconitase基因的cDNA序列,该片段序列长2945 bp,编码883个氨基酸。荔枝果皮Aconitase基因在转录水平随着果皮着色的加深呈不断上升变化,与其在果皮成熟过程中的蛋白水平表达趋势一致。 ⑥克隆了荔枝果皮ASR基因的cDNA序列,该片段序列长515 bp,编码99个氨基酸。荔枝果皮ASR基因在转录水平随着果皮着色的加深呈先上升后下降的变化,在阶段Ⅱ的表达量最高,与其在果皮成熟过程中的蛋白水平表达趋势一致。 ⑦克隆了荔枝果皮TCTP基因的cDNA序列,该序列全长848bp,其中开放阅读框(ORF)共有507 bp,编码168个氨基酸。荔枝果皮TCTP基因在转录水平随着果皮着色的加深呈先上升后下降再上升的变化,与其在果皮成熟过程中的蛋白水平表达趋势不太一致。 ⑧克隆了荔枝果皮14-3-3基因的cDNA序列,该序列全长1084 bp,其中开放阅读框(ORF)共有792 bp,编码261个氨基酸。荔枝果皮14-3-3基因在转录水平随着果皮着色的加深呈先上升后下降再上升的变化,与其在果皮成熟过程中的蛋白水平表达趋势不太一致。 ⑨克隆了荔枝果皮VSP基因的开放阅读框(ORF),该序列长678 bp,编码225个氨基酸。荔枝果皮VSP基因在转录水平随着果皮着色的加深呈不断下降变化,与其在果皮成熟过程中的蛋白水平表达趋势一致。
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