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《福建农林大学》 2011年
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龙眼体胚发生过程中SOD基因家族的克隆及表达调控研究

林玉玲  
【摘要】:龙眼(Dimocarpus longan Lour.)是我国南方重要的热带亚热带木本果树,其胚胎发育状况与其果实的产量及品质密切相关。植物胚胎的发育是一个细胞分化的过程,该过程中必然有氧化胁迫的影响,而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)作为抗氧化系统的第一道防线在植物胚胎的细胞分化和发育过程中起着重要作用。本研究利用龙眼体胚发生模式实验系统,在进行龙眼体胚发生过程SOD的生理生化研究的基础上,进一步进行SOD基因家族克隆及表达调控机制研究(启动子分离与功能鉴定、miRNA分离与鉴定以及相关基因和miRNA定量表达分析等),以探讨在龙眼体胚发生中SOD的作用的分子机制,并为龙眼活体胚胎发育中的SOD作用机制提供参考。主要结果如下: 1.龙眼体胚发生过程中SOD酶活性变化及同工酶分析 在本研究中首先对龙眼活体晚期胚胎和早期离体胚胎中的SOD活性及同工酶谱进行了初步分析。结果发现,不管是龙眼晚期活体胚胎或早期离体胚胎,随着龙眼胚胎的进一步发育,SOD的活性均呈逐渐升高趋势,说明SOD对胚性细胞的分化以及晚期胚胎发育具有促进作用。温度处理对龙眼体胚发生早期SOD活性影响较小,而对SOD同工酶谱影响较大,表现为谱带的出现与消失,其中25℃处理的龙眼胚性培养物,SOD同工酶谱条带数最多,而20℃和30℃处理的材料,表达较弱的酶谱条带消失。提示SOD活性与同工酶谱的规律变化与龙眼体胚发生早期细胞分化、超氧自由基的清除以及促使体胚正常发育有密切关系。 2.龙眼胚性愈伤组织SOD基因家族cDNA和DNA全长的获得 在酶活性测定的基础上,利用RT-PCR和RACE法从龙眼胚性愈伤组织中获得SOD基因家族20个不同mRNA转录本,它们分别编码细胞质DlCSD1a和DlCSD1b、叶绿体DlCSD2a、叶绿体DlFSD1a、DlFSD1b及线粒体DlMSD等,这是木本植物SOD首次克隆较为完整的,也是植物体胚SOD基因分离较为完整的;SOD基因家族各成员的3’UTR序列的长度都具有多态性,可能与miRNA的转录后水平调控相关;此外,还获得了DlCSD1a-4、DlCSD1a-5、DlCSD1b- variant1和DlFSD1b-variant1~ DlFSD1b-variant4等7个不同的可变剪接体,它们发生剪接的位置不尽相同,并存在各自不同的剪接模式。DlCSD1a基因基因组序列长2741 bp,含8个内含子;DlCSD1b基因长4592 bp,含6个内含子;DlCSD2a基因长3727 bp,含7个内含子;DlFSD1a基因长2171 bp,含6个内含子;DlFSD1b基因长2137 bp,含7个内含子;DlMSD基因长1589 bp,含5个内含子;所有内含子的剪切位点均符真核生物GT-AG规则。不同基因所含内含子和外显子的长度不一,其中DlCSD1b的第5个内含子、DlCSD2a的第6个内含子的长度较长,分别为3539 bp和2178 bp,长内含子的存在可能有利于产生多种mRNA分子,编码出多种功能的蛋白质。 3.龙眼胚性愈伤组织SOD基因家族生物信息学分析 根据生物信息学分析结果,龙眼胚性愈伤组织DlSODs编码的蛋白质不同成员均含有SOD典型的保守结构域,属于超氧化物歧化酶大家族的不同成员,它们在进化上具有高度保守性,在功能上也具有较大相似性,均为亲水的酸性蛋白,除DlFSD1a和DlFSD1b外,其余均为稳定蛋白。不过不同类型的SOD又具有各自特点,它们在龙眼体胚中的可能作用机理:①DlCSD1a和DlCSD1b定位于细胞质,不含信号肽,不进行跨膜运动,两者相互协调主要负责细胞质中活性氧等的清除,并以丝氨酸为主和苏氨酸的位点为辅发生磷酸化;②DlCSD2a定位于叶绿体,含有信号肽,以由叶绿体内膜到叶绿体外膜上方式进行跨膜运动,主要负责叶绿体细胞中活性氧等的清除,并以丝氨酸为主和苏氨酸为辅的位点发生磷酸化;③DlFSD1a定位于叶绿体,含有信号肽,不含跨膜结构域,可能与DlCSD2a协同作用负责叶绿体细胞中活性氧等的清除,并以丝氨酸为主、苏氨酸及酪氨酸为辅的位点发生磷酸化;④DlFSD1b和DlFSD1b(JF316733)可能定位于过氧化物酶体和细胞质,均不含信号肽,含2个跨膜结构域,倾向于由外到内进行跨膜运动,并以酪氨酸为主、丝氨酸及苏氨酸为辅的位点发生磷酸化;⑤DlMSD定位于线粒体,不含信号肽,存在从线粒体内膜到外膜或从外膜到内膜的双向跨膜运动的2个跨膜螺旋结构域,主要负责线粒体细胞中活性氧等的清除,并以丝氨酸为主、苏氨酸及酪氨酸为辅的位点发生磷酸化。 4.龙眼胚性愈伤组织SOD基因家族启动子克隆和功能鉴定 为进一步了解SOD基因家族在转录水平上的调控作用,本研究采用Tail-PCR法和IPCR法,分别获得了DlCSD1a、DlCSD2a、DlFSD1a和DlMSD基因启动子序列,长度分别为2252 bp、164 bp、1080 bp和843 bp,其中,DlCSD1a启动子区域含有2个内含子序列。利用RLM-RACE法鉴定DlSODs基因家族的TSS,结果显示它们都含有丰富的TSS,数量从3 ~ 10个不等;5’UTR长度波动范围较大,介于11~193 bp之间;TSS碱基组成一般以A为主,其次为G和C,还少数出现T。龙眼DlSOD基因家族不同成员存在多个TSS且各TSS起始mRNA转录效率不同,暗示RNA聚合酶和调控因子在DlSOD基因家族启动子的一个较宽范围内的互作控制了转录的效率。PlantCare软件分析显示,DlCSD1a、DlCSD2a和DlFSD1a基因启动子区域中,均含有核心启动子元件和基本启动子区,但DlMSD基因5’端基础启动区缺少TATA和CAAT盒;此外,还存在大量与光响应、激素应答、环境胁迫响应、胚乳特异表达响应、细胞周期相关响应及大量的功能未知或功能特异的相关元件;另外不同成员SOD基因还存在各自功能特异的顺式元件。此外,DlCSD1a和DlFSD1a基因可能受bZIP类转录因子调控,而DlMSD可能受WRKY类转录因子的调控。在此基础上,还构建它们3’/5’不同缺失突变体的瞬时表达载体,为将来功能验证实验奠定基础。 5.龙眼体胚发生过程中调控SOD基因家族的小分子RNA的分离与鉴定 为了解DlSODs基因在转录后水平上的表达调控机制,本研究首先采用Solexa技术对龙眼体胚发生过程中的sRNA进行测序。结果表明:共得到Unique序列6,553,782条,其中仅13,151条序列与已知miRNAs相似;sRNA以24 nt的长度为主要存在方式;龙眼体胚发生过程中miRNA的表达丰度存在巨大差异,其中大部分为低丰度表达;总共鉴定了367个保守miRNA,构成众多家族,不同家族间成员数量存在巨大差异;另外获得23个候选的新miRNA,其中有10个miRNA含单个基因座,另13个miRNA具备多个基因座。在上述基础上,结合psRNA Target预测软件和RLM-RACE法最终鉴定到调控DlSODs的11个dlo-miRNAs,它们以裂解DlSODs mRNA的方式调控其在龙眼体胚发生过程中的转录后水平表达。这11个dlo-miRNAs分别是dlo-miR156(靶标DlCSD1a);dlo-miR159、863-3p、1023b-3p、1223和2643(靶标DlCSD1b);dlo- miR159、398、1171a和1171b(靶标DlCSD2a)以及dlo-miR808和2089(靶标DlFSD1a),它们在龙眼体胚发生过程中呈较大差异表达,推测其差异表达导致了不同类型SOD基因在龙眼体胚发生过程中表达模式的不同。此外利用RT-PCR法克隆获得pre-miR398a/b序列,它们与其它植物的前体序列具有高度保守性。 6.龙眼体胚发生过程中SOD基因家族及miRNA定量表达分析 ①龙眼体胚发生过程中SOD基因家族表达模式分析 在上述研究的基础上,以及对龙眼体胚发生过程中qPCR内参基因筛选的基础上,对不同类型DlSODs的表达模式进行分析。首先,不同类型DlSODs在龙眼体胚发生过程中的表达变化趋势比较接近,它们主要在体胚发育的中期和成熟胚中起作用。从松散型胚性愈伤组织开始到成熟胚等9个阶段,它们总体的表达变化趋势主要体现为“递增(胚性愈伤II)-递减(不完全胚性紧实结构)-递减(紧实胚性球形结构)-递减(球形胚)-递增(心形胚)-递减(鱼雷形胚)-递减(子叶形胚)-递增(成熟胚)”模式。其次,不同类型SODs在龙眼体胚不同发育阶段有明显的分工。在胚性愈伤组织II和心形胚阶段,所有类型SOD都介导了其发育;球形胚阶段的形态建成则主要由DlCSD1a-5和DlCSD1b-2负责;鱼雷形胚阶段的发育主要受DlFSD1a、DlFSD1b和DlMSD的调控;在子叶形胚阶段,所有类型SODs的转录水平均很低;在成熟胚阶段的形态建成则主要以DlCSD1a为主,DlMSD为辅负责。此外,还研究了DlSODs基因家族与其它抗氧化系统的相关基因CAT和POD和分子伴侣DlCCS之间表达模式的相互关系,表明CAT、POD等抗氧化系统相关基因与DlSODs的相互协调表达,从而保证了ROS网络的正常运行;DlCCS的正常稳定表达对维持DlCSDs正常发挥生物学功能是必须的,但DlCSDs的激活也并不完全依赖于DlCCS的存在。 ②龙眼体胚发生过程中miRNAs表达模式分析 在龙眼体胚发生过程中qPCR miRNA内参基因筛选的基础上,对20个dlo-miRNAs的表达模式进行分析。dlo-miR3,5,10,12,13,156a,156c,397a,398b.1,398b.2,398b.3,808和2089*等miRNA共同介导了龙眼体胚发生早期的形态建成,它们均在体胚发生早期球形胚之前大量表达,晚期表达量多数下降,部分miRNA甚至不表达;dlo-miR6、160a和167a可能在龙眼体胚发生的中晚期起主要作用。dlo-miR6、160a转录水平的累积对龙眼心形胚和鱼雷形胚的形态建成可能是必须的;dlo-miR167a在龙眼子叶胚和成熟胚中起主要作用;而dlo-miR159a.1、159a.2、159c和159f在龙眼体胚发生过程中的表达均比较稳定。以上说明miRNAs表达的组织和时空特异性共同介导了龙眼体胚的发生。 ③龙眼体胚的发生过程miRNA与DlSODs表达模式的比较分析 miRNA-DlSODs的协调表达参与调控了龙眼体胚的发生。对miRNA与DlSODs表达模式进行比较分析表明:dlo-miR156家族、159家族、398b家族、808和2089*在龙眼体胚发生过程中均有特异性扩增,且表达量能与相应靶基因呈负相关;然而dlo-miR863-3p、1023b-23p、1171a/b、1223和2643却未能得到特异性扩增但却能鉴定到它们裂解的mRNA片段,提示在龙眼体胚中可能还存在其它潜在的miRNA或内源siRNA介导了DlSODs的表达。此外,不同miRNA成员间在不同发育阶段具有明确的分工,甚至不同miRNA成员可能控制着相应mRNA转录本的表达,如dlo-miR159家族的4个成员分别调控着DlCSD1b、DlCSD2a不同发育阶段的表达。在龙眼体胚发生早期(球形胚前),它们的表达主要由dlo-miR159a.1负责;从球形胚到心形胚则由dlo-miR159c和159f负责;心形胚到成熟胚阶段由dlo-miR159a.2和dlo-miR159c负责,这种现象还在dlo-miR156家族及398b家族出现。这可能提示当miRNA某个成员不能裂解mRNA表达时,另外一些成员则对其功能进行互补,从而实现对靶基因转录后水平的调控。dlo-miR159同时介导DlCSD1b和DlCSD2a的表达,并负责协调不同靶基因间的表达变化趋势;miRNA可能以裂解靶基因mRNA的降解或抑制靶蛋白质翻译两种调控机制并存的方式同时介导靶基因的表达。此外,dlo-miR398b与pre-miR398b的表达模式基本一致,它们与靶基因DlCSD2a的表达模式刚好相反,说明前体miRNA能在一定程度上反应成熟miRNA的表达情况。 综上所述,龙眼体胚发生过程中DlSODs的表达调控机制可能是:当外界环境因子发生改变时(内源激素或外界环境因子胁迫),细胞内活性氧水平发生变化,进而启动相关调控因子[(转录因子bZIP、WRKY、miRNAs(dlo-miR156、159、398、808和2089*)、磷酸化作用)]转录水平的变化从而调控DlSODs的表达,使之最终参与龙眼体胚发生过程中的基础代谢、激素信号转导、细胞凋亡、氧化胁迫等生理过程,从而最终影响其发育的整体进程。总之SOD的表达是多种因子共同构成的一个复杂调控网络。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S667.2

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9 宋东辉;水稻抗病性相关的蛋白激酶基因OsBIMK2和OsBISERK1的克隆鉴定与功能分析[D];浙江大学;2004年
10 许姣卉;小金海棠超氧化物歧化酶基因克隆与分析[D];中国农业大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王红波;矮牵牛组织培养体系的建立和ACO基因cDNA的克隆[D];中南林业科技大学;2010年
2 张锐;福建野生蕉资源RAPD分析、离体培养与SOD基因克隆[D];福建农林大学;2011年
3 李然;龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程的蛋白质组学研究[D];福建农林大学;2011年
4 陈晓东;柑橘试管苗种质保存及其microRNA鉴定[D];福建农林大学;2011年
5 张庆举;橄榄叶类黄酮合成相关基因cDNA的克隆和生物信息学分析[D];福建农林大学;2011年
6 姜顺日;孔雀草试管开花及蛋白质组学研究[D];福建农林大学;2011年
7 马金玉;龙眼体胚发生过程中若干PCD相关基因的克隆及表达[D];福建农林大学;2011年
8 孔刚;福建杜鹃花遗传多样性ISSR分析及其离体保存[D];福建农林大学;2011年
9 张振华;石斛兰文心兰转CyMV-CP、ORSV-CP基因研究[D];海南大学;2011年
10 万婷;油松胚性愈伤组织诱导研究[D];山西大学;2011年
【二级引证文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 方智振;周丹蓉;姜翠翠;廖汝玉;叶新福;;李Ran基因的克隆与生物信息学分析[J];分子植物育种;2014年04期
2 刘炜婳;赖钟雄;;福州宦溪野生蕉(Musa spp.,AB group)2个PSAG成员的克隆及生物信息学分析[J];热带作物学报;2013年01期
3 蔡爱萍;赖钟雄;;龙眼古树胚性愈伤组织Dlwrky44基因的克隆及分析[J];热带作物学报;2013年05期
4 田奇琳;林玉玲;赖钟雄;王天池;;龙眼胚性愈伤组织DlRan3A和DlRan3B基因启动子的克隆及其生物信息学分析[J];热带作物学报;2014年01期
中国硕士学位论文全文数据库 前8条
1 任敬敬;龙眼体胚发生过程中谷胱甘肽代谢相关基因的克隆及其表达分析[D];福建农林大学;2013年
2 李丽秀;枇杷种质限制生长保存及乙烯代谢与信号转导相关基因等克隆及表达[D];福建农林大学;2013年
3 刘敏;孔雀草试管开花条件的优化及其分子机制研究[D];福建农林大学;2013年
4 陈燕梅;福建名优菊花工厂化试管育苗关键技术研究[D];福建农林大学;2013年
5 曾丽兰;龙眼胚性愈伤组织SOD的表达分析及启动子功能鉴定[D];福建农林大学;2013年
6 蔡爱萍;龙眼古树EC离体保存及其WRKY基因家族的克隆与表达[D];福建农林大学;2013年
7 刘炜婳;福建野生蕉离体繁殖及其抗性基因克隆与定量表达分析[D];福建农林大学;2013年
8 赖恭梯;福建香蕉种质资源试管保存及野生蕉ISSR与抗寒性分析[D];福建农林大学;2014年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 胡宝成;S.R.Rimmer;;油菜菌核病离体叶片接种法研究初报[J];安徽农业科学;1989年03期
2 宋婉,续九如;果树种质资源鉴定及 DNA 指纹图谱应用研究进展[J];北京林业大学学报;2000年01期
3 金虬,程志明,李大珍;胶束对几种Cu(Ⅱ)─氨基酸络合物SOD样活性的影响[J];北京师范大学学报(自然科学版);1996年03期
4 王玉民,刘艳芝,夏彤,李望丰,李俊波,董英山;苜蓿子叶体细胞胚的诱导和植株再生(简报)[J];草地学报;2005年01期
5 张寒霜,李俊兰,高鹏,王海波;低酚陆地棉的体细胞胚胎发生和植株再生[J];河北农业大学学报;1999年01期
6 刘振虎,卢欣石,葛军;紫花苜蓿愈伤组织及体细胞胚的细胞学观察[J];草业科学;2005年02期
7 陈万利,刘宗旨,李文华;植物富含甘氨酸蛋白质(GRP)及其基因研究进展[J];东北农业大学学报;2005年04期
8 陈婷,栾恒淳,李力,王丽;水稻悬浮体细胞胚胎发生及其特异蛋白[J];东北师大学报(自然科学版);2000年04期
9 李福山;大豆起源及其演化研究[J];大豆科学;1994年01期
10 杨庆凯;目前大豆生产面临的挑战及对策[J];大豆通报;1999年06期
中国重要会议论文全文数据库 前2条
1 商海红;刘传亮;张朝军;武芝霞;李付广;;棉花体细胞胚发生机理的研究进展[A];中国棉花学会2007年年会论文汇编[C];2007年
2 肖洁凝;吴蓓;陈启助;吴永杰;李运合;蔡刘体;陈云凤;李筱菊;黄学林;;芒果子叶体细胞胚胎发生的调控及其不定根形成相关基因的研究[A];中国植物生理学会第九次全国会议论文摘要汇编[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前4条
1 王凤华;龙眼体细胞胚胎发生过程中的基因差别表达[D];福建农林大学;2003年
2 苗红梅;小麦淀粉合成关键酶基因启动子的克隆与特征[D];河南农业大学;2004年
3 戴均贵;银杏组织与细胞培养及银杏内酯B产生的研究[D];中国协和医科大学;1999年
4 郭志雄;龙眼胚胎乙醇脱氢酶的分离纯化、鉴定及其cDNA克隆[D];福建农林大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前3条
1 陈春玲;龙眼体细胞胚胎发生机理的初步研究[D];福建农林大学;2001年
2 陆军;水分胁迫和ABA处理对玉米叶片不同亚细胞区室中抗氧化防护系统的影响[D];南京农业大学;2005年
3 李惠华;龙眼体胚发生过程中APX的生理学与分子生物学研究[D];福建农林大学;2005年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 曾范利;胡玉庆;刘新宇;王春芳;姜秀云;;副结核分枝杆菌SOD基因在大肠杆菌中的表达[J];中国人兽共患病学报;2009年01期
2 胡玉庆;曾范利;刘新宇;宁浩然;姜秀云;;副结核分枝杆菌SOD基因在BHK-21细胞中的表达[J];中国兽药杂志;2010年07期
3 邹媛媛;李轶女;朱越雄;;东方粘虫颗粒体病毒超氧化物歧化酶基因的克隆与分析[J];昆虫知识;2008年05期
4 王宇光,郭建春,郑学勤;西红柿CU/ZnSOD基因在大肠杆菌中高效表达的研究[J];热带作物学报;1995年S1期
5 徐家萍,王文兵,陈克平,赵远;柞蚕核型多角体病毒sod基因核心序列的克隆与分析[J];安徽农业大学学报;2004年02期
6 曾凡利;胡玉庆;徐凤宇;王春芳;姜秀云;;副结核分枝杆菌SOD基因的克隆与序列分析[J];中国兽药杂志;2008年03期
7 覃鹏,孔治有,刘叶菊,刘飞虎;水分胁迫对烟草转SOD基因品系光合特性的影响[J];江苏农业学报;2004年02期
8 覃鹏;刘飞虎;孔治有;刘叶菊;;转SOD基因对烟草抗旱性和相关生理指标的影响[J];广西植物;2006年06期
9 曹淑华,查向东;超氧化物歧化酶研究综述[J];安徽农业科学;2003年04期
10 唐云明,鲁成,向仲怀,许禾声;家蚕铜锌超氧化物歧化酶cDNA的克隆与测序[J];动物学报;2003年04期
中国重要会议论文全文数据库 前6条
1 项翠琴;梅兵;吴自荣;张云英;沈红;阮素云;顾祖维;;低剂量镉对肾脏SOD基因表达及其活性的影响[A];海峡两岸首届毒理学研讨会论文(摘要)集[C];2001年
2 刘晓鹏;程群;覃大吉;吴承金;袁勤生;;转rh-SOD基因马铃薯活性氧的代谢及保护酶的变化[A];2004年全国生物技术学术研讨会论文集[C];2004年
3 尚玉磊;王琦;张炳欣;梅汝鸿;;蜡样芽孢杆菌M22超氧化物歧化酶基因克隆及原核表达[A];中国植物病理学会2004年学术年会论文集[C];2004年
4 王昌涛;赵琦;杨爱国;贾正正;赵玉锦;张世煌;;农杆菌介导超氧化物岐化酶基因(Fe-SOD)在玉米中的遗传转化[A];2004全国玉米种质扩增、改良、创新与分子育种学术会议论文集[C];2004年
5 尚玉磊;王琦;;植物内生蜡样芽孢杆菌M22超氧化物歧化酶基因的克隆及表达[A];第六届全国自由基生物学与自由基医学学术会议和海峡两岸自由基生物学与自由基医学学术会议论文集[C];2004年
6 刘一凡;;超氧化物歧化酶分子生物学研究概况[A];第四次全国中西医结合养生学与康复医学学术研讨会论文集[C];2004年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 余志平;白血病治疗新药物——超氧化物歧化酶抑制剂[N];中国医药报;2001年
中国博士学位论文全文数据库 前3条
1 尚玉磊;植物内生蜡样芽孢杆菌M22超氧化物歧化酶基因克隆及体外表达酶活性分析[D];浙江大学;2004年
2 唐云明;家蚕超氧化物歧化酶的分离纯化及其基因克隆[D];西南农业大学;2001年
3 张欣欣;活性氧对耳蜗损伤的分子机制研究[D];军医进修学院;2001年
中国硕士学位论文全文数据库 前7条
1 胡玉庆;副结核分枝杆菌SOD基因对实验动物免疫研究[D];吉林农业大学;2008年
2 曾范利;副结核分枝杆菌SOD基因的克隆及原核表达[D];吉林农业大学;2007年
3 秦峰松;蛹虫草SOD基因全长cDNA的克隆及在大肠杆菌和烟草中的表达[D];中国农业大学;2003年
4 张克烽;杂色鲍sod、cat和mpeg基因的克隆与分析[D];集美大学;2007年
5 崔家骏;小麦叶绿体抗氧化酶基因的克隆与遗传转化的研究[D];山东农业大学;2002年
6 贾艳坤;锰超氧化物歧化酶基因多态性与2型糖尿病微血管并发症相关性研究[D];天津医科大学;2004年
7 张俊祥;抗氧化酶类和耐辐射奇球菌抗紫外辐射的研究[D];武汉大学;2003年
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