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《福建农林大学》 2013年
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水稻直链淀粉合成基因OsgbssⅡ的研究

姚玉仙  
【摘要】:不同直链含量的淀粉在食品、医疗、工业、环境保护等行业中都有广泛的应用。水稻在全世界种植面积大,产量高。因此,培育不同直链淀粉含量的水稻品种意义重大。水稻中直链淀粉合成相关的基因主要有OsgbssⅠ和OsgbssⅡ两个基因,OsgbssⅠ基因主要与胚乳等存储型器官中直链淀粉的合成有关,研究比较详细。而OsgbssⅡ基因主要在茎、叶片等光合组织临时性存储淀粉的器官中合成直链淀粉,对该基因的研究相对较少,该基因的功能及作用特征还未完全明了。本论文从水稻中克隆并构建了OsgbssII基因的植物表达载体,对转OsgbssII基因水稻的基因表达及淀粉含量等表型进行了分析,初步结果如下: 1.不同启动子驱动下OsgbssII基因在水稻中的表达及转基因株系表型 对3个过表达载体和1个反义载体转基因T3代纯合株系种子发育过程中OsgbssII基因表达定量分析显示:由胚乳特异表达启动子SBEIIb驱动的gbssII和玉米Ubi启动子驱动的gbssII转基因水稻的幼嫩种子中,gbssII基因表达量在花后6d时分别是同期对照的2倍和3倍,12d时分别是对照的14倍和23倍,均达到极显著差异水平;转Gt1-gbssⅡ株系幼嫩种子中,gbssⅡ基因表达量在花后6d、12d时分别是同期对照的2倍和7倍,显著高于对照,但未达到极显著差异水平;转Ubi-gbssII株系倒二叶片中gbssⅡ基因表达量在花后各时期均显著高于Ubi-antigbssⅡ株系和对照,其中花后6d时是对照的5倍,达到高峰。反义表达的Ubi-antigbssⅡ株系叶片中gbssⅡ基因表达量在各时期较对照有所降低,但未达到显著差异水平。 对花后3d、6d、12d时幼嫩种子中直链淀粉占总淀粉百分含量的测定结果显示:Ubi-gbssⅡ株系在3d和6d时较同期对照分别提高了53.2%、55.5%,达到极显著差异水平;IIb-gbssⅡ株系在花后6d时比对照提高了41.1%,达到显著差异水平;转Gt1-gbssⅡ株系较对照有所提高,转Ubi-antigbssⅡ株系较对照有所降低,但都未达到差异显著水平。 成熟种子中直链淀粉含量分析显示:转IIb-gbssⅡ株系和Ubi-gbssⅡ株系较对照分别提高2.98%、5.8%,达到显著和极显著差异水平;转Gt1-gbssⅡ株系和Ubi-antigbssⅡ株系较对照分别提高1.64%和降低1.33%,均未达到差异显著水平。 对转基因水稻成熟种子淀粉颗粒形态分析显示:转IIb-gbssⅡ、Ubi-gbssⅡ株系的淀粉粒颗粒形态较对照小,有明显的晶体棱角,排列致密;而非转基因对照的淀粉粒有大、小两种不同的颗粒形态,排列疏松,表面光滑;转Gt1-gbssⅡ株系中大多数淀粉粒聚合在一起形成簇状结构,还有少数淀粉粒游离于簇之间。 2.构建OsgbssⅠ、OsgbssⅡ基因启动子互换过表达载体和RNAi干扰载体,进一步分析OsgbssⅡ基因的作用。 构建了OsgbssⅠ、OsgbssⅡ基因启动子互换过表达载体和RNAi干扰载体3个,分别是:1301-OsgbssⅠp-OsgbssⅠRNAi-OsgbssⅠp-OsgbssⅡ,1301-OsgbssⅡp-OsgbssⅡRNAi-OsgbssⅡp-OsgbssⅠ,1301-OsgbssⅠp-OsgbssⅠRNAi-OsgbssⅡp-OsgbssⅡRNAi,并用农杆菌转化法分别获得转基因克隆43个、46个和41个。 对转3个载体T0代植株的OsgbssⅠ、OsgbssⅡ基因表达定量检测发现:转1301-OsgbssⅡp-OsgbssⅡRNAi-OsgbssⅡp-OsgbssⅠ株系在花后0d、3d、6d、12d时,倒二叶片中gbssⅠ基因表达量分别是同期对照的25倍、1578倍、625倍、220倍,差异均极显著;而转另2个载体株系及对照叶片中gbssⅠ基因表达量在各时期均几乎为0;表明OsgbssⅡp启动子驱动了OsgbssⅠ基因在叶片中表达,同时表明水稻内源OsgbssⅠp启动子不能驱动OsgbssⅠ基因在叶片中表达。 转基因成熟种子中直链淀粉含量测定结果显示:OsgbssⅡp驱动OsgbssⅠ基因表达的转1301-OsgbssⅡp-OsgbssⅡRNAi-OsgbssⅡp-OsgbssⅠ株系成熟种子的直链淀粉含量最高,较对照提高3.58%;OsgbssⅠ、OsgbssⅡ两个基因都被干扰的转1301-OsgbssⅠp-OsgbssⅠRNAi-OsgbssⅡp-OsgbssⅡRNAi株系最低,较对照降低6.91%;均未达到显著差异水平。 3.构建OsgbssⅡ基因原核表达载体,经IPTG诱导后,在70KD附近出现少量目的蛋白产物。需对蛋白进一步纯化并后续制备抗体,以期获得OsGBSSII抗体。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:S511

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【参考文献】
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