创伤弧菌DNA疫苗载体的构建及表达分析

【摘要】：创伤弧菌(Vibrio vulnificus),又名海洋弧菌,其属于弧菌属,是一种革兰氏阴性,嗜盐性的杆状细菌,常存在于海鲜与海水中,能引起水产鱼类疾病。鳗鲡感染此菌可引起出血病,且发病速度快,死亡率高,对鳗鲡养殖业造成巨大的经济损失。目前防治此病主要是使用广谱类抗菌药物,基于食品安全和环境保护的理念,研发相关特异性疫苗已迫在眉睫。本研究以创伤弧菌FJ03-X2株的脂蛋白Lpp和外膜蛋白OmpK为目的基因,构建了创伤弧菌DNA疫苗真核表达载体pcDNA3-lpp和pcDNA3-ompk,并在真核细胞中检测到目的基因的表达,具体如下： FJ03-X2株为本实验室于2003年在福建长乐某鳗鲡场分离、鉴定和保存。根据GenBank记载创伤弧菌ATCC29307株lpp基因序列和创伤弧菌1.1758株ompk基因序列,设计引物,首次克隆到创伤弧菌FJ03-X2株的lpp和ompk基因。利用在线网络分析两种蛋白的亲疏水性,抗原表位、糖基化位点、磷酸化位点和二级结构。构建pMD18-T-lpp和pMD18-T-ompk重组质粒,获得基因片段。 构建原核表达重组质粒pET-32a-lpp和pET-32a-ompk,转化E.coli BL21(DE3)表达蛋白。SDS-PAGE电泳检测,加上标签后,Lpp蛋白大小为47kDa,OmpK蛋白大小为45kDa,符合预期结果。纯化目的蛋白,并免疫SPF级SD大鼠,获得大鼠多克隆抗血清。ELISA检测血清效价,鼠抗Lpp蛋白血清和鼠抗OmpK蛋白血清效价均为1：128000。免疫印记实验证明多克隆抗血清可识别创伤弧菌的脂蛋白Lpp和外膜蛋白OmpK。经检测,两种抗血清均具有较高的特异性。 构建创伤弧菌DNA疫苗真核表达载体PcDNA3-lpp和pcDNA3-ompk。将带有目的基因的质粒与pEGFP-N1(绿色荧光蛋白基因)以10：1的比例,通过脂质体共转染293细胞,48h后观察绿色荧光蛋白的表达,并通过RT-PCR检测目的基因mRNA水平的表达,Western-blot检测到目的蛋白的表达。结果显示重组目的基因在293细胞中的表达获得成功。