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小菜蛾中肠微生物多样性及其功能研究

夏晓峰  
【摘要】:小菜蛾Plutella xylostella (L.)是世界范围内对十字花科蔬菜危害最严重的害虫之一。杀虫剂的大量不合理使用,使小菜蛾产生广泛的抗药性,给蔬菜生产造成严重影响。小菜蛾的抗药性及其专性取食十字花科蔬菜的特性成为目前研究小菜蛾的两个重要方向。昆虫肠道微生物在食物消化、生长发育、免疫以及抵御病原菌等方面都起着重要作用。近年来的研究表明昆虫肠道微生物还参与了食性以及杀虫剂的抗性。本文针对上述两个科学问题,分析了小菜蛾中肠细菌协助宿主参与食物消化、营养供给以及宿主植物解毒等机制;同时揭示了中肠细菌介导小菜蛾抗药性的效应和机理。主要研究结果如下: 1、小菜蛾中肠微生物的多样性 本文综合运用16S rRNA V6高变区测序、宏基因组测序以及传统微生物分离纯培养的方法分析小菜蛾中肠微生物的多样性。三种方法均表明小菜蛾三龄幼虫中肠细菌中变形菌门Proteobacteria是丰度最高的细菌种属,其次是厚壁菌门Firmicutes,这两个门的细菌占小菜蛾中肠细菌总量的97%以上。变形菌门中丰度最高的目是肠杆菌目Enterobacteriales,厚壁菌门主要由乳杆菌目Lactobacillales组成;肠杆菌目中的阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae和阿氏肠杆菌Enterobacter asburiae丰度最高,乳杆菌目中的肉杆菌Carnobacterium maltaromaticum丰度最高,这三个种的细菌占小菜蛾中肠细菌总量的60%以上。幼虫、蛹和成虫中肠中的物种多样性比较分析表明三个不同发育阶段中肠微生物多样性在属以上的分类级别没有太大的变化,仅仅是在蛹和成虫中变形菌门的数量略微上升,相对的厚壁菌门的丰度下降。但是在种的分类水平上,相对于幼虫和蛹,成虫期Enterobacter asburiae的丰度有较大的升高,相应的Enterobacter cloacae的丰度下降,由于幼虫专性取食十字花科植物,而成虫只以蜂蜜为食物,因此该菌属的改变很可能与其食物的转变有关,提示小菜蛾中肠细菌可能在食物的消化代谢和营养供给上起作用。抗性品系和敏感品系小菜蛾中肠细菌的差异比较分析发现,抗性品系小菜蛾中肠细菌厚壁菌门丰度升高,变形菌门丰度下降,农药胁迫下该趋势进一步增强,提示小菜蛾中肠细菌的组成和结构还可能与农药的抗性有关。 2、小菜蛾中肠微生物与食性 基于小菜蛾中肠微生物的宏基因组,结合功能验证试验,我们分析了小菜蛾中肠微生物参与食物消化、营养供给和对宿主植物代谢解毒的功能。研究发现小菜蛾中肠微生物能够编码纤维素降解酶、木聚糖酶和果胶酶,功能验证试验也表明小菜蛾中肠细菌能够有效降解纤维素、木聚糖和果胶,帮助宿主进行食物的消化。基于小菜蛾的基因组,我们发现小菜蛾自身并不能合成组氨酸histidine (His)和苏氨酸threonine (Thr),但是小菜蛾中肠微生物的宏基因组中具有合成组氨酸和苏氨酸的完整代谢途径,提示小菜蛾中肠微生物可能为宿主提供必需氨基酸,在宿主的营养上起到重要的作用。十字花科植物能够产生大量的次生代谢物,包括植物酚类。一些植物酚类如邻苯二酚通常对植物细胞具有毒性,影响昆虫对食物的消化吸收,且含有邻苯二酚内核的酚类在其被氧化或者有重金属和氧存在时能够诱导活性氧reactive oxygen species (ROS)产生而损害机体,这些有毒酚类物质和ROS组成了植物对昆虫的防御系统。我们在小菜蛾中肠微生物宏基因组中发现了完整的有氧降解邻苯二酚的代谢途径,通过功能验证试验证实了小菜蛾中肠细菌具备降解苯酚的能力;同时研究发现小菜蛾中肠微生物编码了大量的能够帮助宿主将ROS还原成无毒性化合物的超氧化物歧化酶superoxide dismutases (SODs)、过氧化物酶peroxidase和过氧化氢酶catalase。研究结果提示小菜蛾的中肠微生物能够帮助宿主成为一个适应性更强、更加成熟稳定的植食性昆虫。 3、小菜蛾中肠细菌介导的抗药性 利用微生物分离培养和功能验证等方法,研究中肠细菌介导小菜蛾抗药性的效应;在此基础上,进一步研究小菜蛾中肠细菌对宿主抗性基因和免疫基因的表达调控,阐明中肠细菌介导小菜蛾抗药性的机理。利用分离纯化的厚壁菌门细菌肠球菌(Enterococus.sp)和变形菌门细菌肠杆菌(Enterobacter.sp)和沙门菌(Serratia.sp),以及抗生素分别饲喂小菜蛾,肠球菌显著提高了小菜蛾对毒死蜱的抗性,沙门菌显著降低了小菜蛾对毒死蜱的抗性,肠杆菌对小菜蛾毒死蜱抗性的影响不显著;热致死的细菌均不影响小菜蛾对毒死蜱的抗性;此外,抗生素清除肠道细菌后,小菜蛾的抗药性也显著增强。研究结果表明中肠细菌的组成和结构能够影响小菜蛾对农药的抗性。对中肠细菌介导小菜蛾抗性的机理研究中发现,中肠细菌直接参与农药的代谢降解并不是其介导农药抗性的主要机制,厚壁菌门的肠球菌和抗生素对小菜蛾中肠解毒酶基因的调控相似,均能够诱导小菜蛾中肠谷胱甘肽-硫-转移酶glutathione S-transferase(GST)和羧酸酯酶carboxylesterase(COE)基因的高表达,提高小菜蛾对农药的抗性。在中肠细菌介导免疫调控与抗药性关联的研究中发现,能够提高小菜蛾抗药性的肠球菌Enterococcus sp.以及三种化学物质(抗生素、维生素C和乙酰水杨酸)对小菜蛾抗菌肽的调控具有较为相近的模式;而对抗药性具有不同效应的中肠细菌,对小菜蛾抗菌肽的调控方式并不相同,提示中肠细菌介导的抗药性很可能还与其对宿主免疫的调控有关。 本文首次解析了小菜蛾中肠微生物的多样性,利用小菜蛾中肠微生物宏基因组分析了小菜蛾中肠细菌参与食物消化、营养供给和代谢解毒的功能。本研究结合前期对小菜蛾基因组的研究能够提供更宽广的视野去探视小菜蛾专性取食十字花科植物的机制。此外,本文还明确了中肠细菌能够影响小菜蛾的抗药性,并分析了中肠细菌介导小菜蛾抗药性的机理,对进一步研究和揭示小菜蛾的抗药性机制,提高监测预警和持续控制的水平具有重要意义,同时也为研究其它昆虫与肠道细菌之间的相互关系提供思路和理论基础。


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