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基于分子删除策略的新型安全转基因水稻培育技术

胡太蛟  
【摘要】:转基因技术经过三十几年的快速发展获得了巨大的进步,为世界粮食安全作出了重要贡献并展示出广阔的前景。但生物安全性问题的争论,尤其是食品安全性的担忧与疑虑严重阻碍了转基因水稻的发展与推广应用。现有研究表明,基于位点特异重组的外源基因删除策略成为目前解决转基因植物的生物安全性问题的一条理想的途径。本研究利用胚乳特异性启动子调控技术结合高效特异性的位点特异重组系统建立了一种培育新型安全转基因水稻的方法。通过该方法获得的转基因水稻,其种子的胚乳中发生了高效的特异性外源基因删除,使得来源于它们的精米(即稻米的主要可食用部分),其中特定的外源基因被有效删除了。同时,这些种子的胚中并未发生特异性的删除,仍含有转基因水稻的所有遗传特性,能够完整有效地将其遗传给它们的后代。本论文的主要研究结果如下:1.阻断激活验证水稻胚乳高效特异性删除系统的有效性为了验证胚乳高效特异性删除系统在水稻中是否可行,构建了一个水稻遗传表达载体p1300-LF-AGCSGS,其含有胚乳特异性启动子pGtl控制的重组酶cre基因、组成型启动子控制的GUS报告基因以及两个同向的高效识别融合位点loxPFRT,且带有间隔序列的同向融合识别序列被置于组成型启动子与GUS报告基因之间。该载体通过农杆菌介导导入水稻中,经过筛选分化获得转基因水稻植株。对这些获得的转基因水稻及其后代进行检测和分析,结果表明,在转基因水稻种子的胚乳中发生了胚乳特异性的删除,该特异性删除能够稳定地遗传给其后代,并且其特异性删除的频率可达到100%的效果,由此说明,胚乳高效特异性删除系统在水稻中的应用是完全可行的。2.胚乳特异删除外源基因培育安全转基因水稻的方法依据以上对胚乳高效特异性删除系统在水稻中应用的有效性验证实验结果,重新构建了水稻遗传表达载体p1300-LF-GCSAGS,该载体将重组酶表达盒与GUS表达盒都置于两个同向的融合双识别位点LoxPFRT之间,以期通过位点特异重组酶系统来将其全部删除。将该载体p1300-LF-GCSAGS通过农杆菌介导转化水稻后,获得了62株转基因水稻植株。T0代的检测结果表明,所有转基因水稻植株的后代均表现出高效的胚乳特异性的删除效果。进一步的分析表明:该胚乳特异性删除的特征能够稳定地遗传给其后代;删除作用的分子机制符合实验预期;在5个筛选出的单拷贝或低拷贝整合的转基因水稻纯合株系中,其胚乳特异性删除的频率达到100%的效果;其克隆或株系内的平均删除效率最高可达86.48%。以上结果说明,通过胚乳特异删除外源基因来培育新型安全转基因水稻的方法是可行的、有效的。所获得的新型安全转基因水稻的种子,其胚乳中发生了特异性的删除,能将特定的外源基因从水稻胚乳基因组中有效地删除,从而获得安全的转基因水稻精米;同时,这些完整的种子仍保留了转基因水稻的所有优良性状,能保证其后代的优越性。3.杂交途径培育新型安全转基因水稻的方法前述的研究基础表明,将胚乳高效特异性删除系统的重组酶基因和识别位点分别置于父本和母本中,通过有性杂交的途径,也能使之整合到一起,在F1代中同样能获得完整的胚乳特异性删除系统。为了验证这一途径的有效性,本研究分别构建了只含有胚乳特异性启动子pGt1控制的重组酶的载体p1300-GCMS和只含有识别位点的载体p1300-LF-AGS,并分别转化水稻,选取获得的单拷贝转基因纯合株分别作为父本和母本进行杂交。结果表明,在杂交后代中,也能获得胚乳特异性的删除效果,且该删除效果是可以稳定遗传的。


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