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不同倍性割手密遗传多样性及抗病分蘖基因多态性研究

刘新龙  
【摘要】:割手密(Saaccharumspontaneum L.)是现代甘蔗品种十分重要的野生型原始种亲本,主要用于品种的抗性、适应性和产量的改良。我国不仅是割手密的起源中心之一,也是割手密重要的多样性分布中心之一,富含丰富多样的割手密资源类型,即有八倍至十六倍等各种倍性割手密还有非整倍性割手密。百余年的甘蔗遗传育种历史表明,不同倍性割手密资源的利用,开辟了甘蔗杂交育种的历史,改良了甘蔗品种的抗性、适应性和产量,推动了世界甘蔗产业的快速发展。目前,国家甘蔗种质资源圃保育了较多的不同倍性割手密资源,但对它们的利用较少,其优异性状或优异基因被开发利用的程度较低,主要原因在于对它们所具有的优异特性和遗传背景不清。鉴于此,本研究利用表型性状、基因组SSR标记和核糖体ITS序列对国家甘蔗种质资源圃中主要的四种倍性割手密资源(2n = 64,72,80,96)的遗传多样性及遗传关系进行了评价;同时使用中国甘蔗常用亲本为参照,对不同倍性割手密基因组标记和抗性基因标记位点的遗传变异分布情况进行了分析;最后评价了抗黑穗病和强分蘖倍性割手密在抗黑穗病基因GluA1和分蘖基因HTD)2上的多态性及其单倍型在骨干亲本和主栽品种中的分布,以期为不同倍性割手密资源的利用和优异基因挖掘及最终服务于甘蔗生产奠定基础和提供指导。主要研究结果如下:1.对62份不同倍性割手密无性系16个形态性状和4个品质性状的多样性分析表明,形态性状中的质量性状的多样性不高,各性状的Shannon-Wiener多样性指数在0.000-1.0680之间,最高的为57号毛群,其多样性指数为1.0680,其次为叶色,而茎形和芽位没有表现出多样性。对于形态性状中5个产量相关性状,不同倍性割手密具有较高的遗传变异,平均变异系数为35.94%,其中十倍体和八倍体割手密拥有更为丰富的遗传变异;从具体性状来看,单茎重最大,达到51.16%,其次为叶宽和株高。对于4个品质相关性状,不同倍性割手密平均变异系数为21.97%,低于产量相关性状,同样是十倍体和八倍体拥有更为丰富的遗传变异;从具体性状来看,蔗糖分最大,为32.23%,其次为简纯度。产量和品质相关性状之间的相关性分析表明,与产量相关的性状之间或与品质相关的性状之间呈显著的正相关,而产量相关性状中只有茎径与所有品质相关性状呈明显的负相关,因此茎径可作为判定不同倍性割手密品质相关性状的关键指标;另外,产量和品质相关性状的变异与海拔和纬度存在相关性,在低纬度低海拔地区分布的倍性割手密呈现植株高大、茎粗、锤度和糖分低的特点,而在高海拔高纬度地区的倍性割手密呈现植株矮小、茎细、但锤度和糖分较高的特点。依据20个表型性状计算得到的Nei'S1972遗传距离,可将不同倍性割手密无性系聚为3个明显的类群。经过综合比较,云南82-110和云南84-268等10份倍性割手密无性系在产量和品质相关性状上表现优异,可用于甘蔗生产性状的改良。2.基于基因组SSR标记和核糖体ITS序列数据,探讨了四种倍性割手密群体之间的分子遗传多样性和遗传关系,结果表明:十倍体和八倍体在30个基因组SSR位点上表现出较高的多态性,多态信息量PIC值分别为0.9281和0.9248,而九倍体和十二倍体相对较低,分别为0.8254和0.8476;在核糖体ITS序列上,十倍体拥有最多的变异位点和简约信息位点(58个和20个),其次为八倍体(43个和17个),而十二倍体和九倍体具有较少的变异位点和简约信息位点。在四种倍性群体之间,遗传分化系数较小(基因组SSR:Gst = 0.0880和 rDNA-ITS:Gst = 0.0700),基因流值较高(基因组 SSR:Nm = 5.1840和rDNA-ITS:Nm = 3.3200),表明它们之间基因交流频繁,遗传分化不明显。Nei'sunbiased(1978)遗传距离和聚类分析表明,八倍体与十倍体之间遗传距离最小,为0.0106,并聚为一类,表现出较近的亲缘关系,其次是九倍体与八倍体和十倍体亲缘关系较近,聚在一个较大的类群,而十二倍体位于较外的类群,与其它倍性群体之间遗传距离较大,表现出较远的亲缘关系,但相比较与十倍体和八倍体,与九倍体亲缘关系更近点。结合标记数据和地理分布数据,推测九倍体可能来源于十倍体和八倍体的自然杂交而成,而十二倍体可能来源于九倍体的六倍体配子组合而成。各倍性割手密无性系之间的UPGMA分子聚类图表明它们的聚类关系存在一定的地域分布特点,采集区域较近的无性系聚在相同的类群。3.以63份中国甘蔗常用亲本为对照,使用30对基因组SSR和4个抗性基因标记引物检测了 62份不同倍性割手密的标记条带分布情况,结果表明:不同倍性割手密群体共获得513个基因组SSR标记条带和116个抗性基因标记条带,而甘蔗常用亲本群体只获得363个和102个,表明不同倍性割手密群体无论在基因组水平还是抗性基因位点上都拥有较多的遗传变异;在不同倍性割手密群体中,八倍体与十倍体在两种标记上都拥有更多的群体特有带,具有较大的潜力可挖。在基因组水平,不同倍性割手密群体与甘蔗常用亲本群体较低的共有带比例(64.60%),表明它们之间还存在较大的遗传差异,还有大量的遗传变异未渗入到甘蔗亲本中;但在抗性基因位点上,相对较高的共有带比例(82.35%)表明较多的抗性基因变异已渗入到甘蔗亲本中,两种标记共有带比例的差异,说明了割手密抗性基因的人工选择在割手密的利用上扮演了重要角色。在具体的4个抗性基因位点上,不同倍性割手密AQP和DREB基因位点的变异位点被利用的较为充分,而HSP70和WRKY1基因位点的变异被利用的相对较少,还有较大的开发利用价值。从所有参试材料拥有的基因组SSR标记和抗性基因标记扩增条带数来看,福建89-1-17、广东16号、四川79-2-16和福建仙游等4份倍性割手密都拥有超过170个基因组SSR标记条带,而在甘蔗常用亲本群体中,ROC16、ROC25、ROC22、F172、CP72-1312、FR93-435和ROC20等7份材料拥有的基因组SSR标记条带较多,都超过150个,表明这些倍性割手密或常用亲本材料在基因组水平都富含丰富的遗传变异。在抗性基因标记位点上,倍性割手密贵州78-1-11和云南83-213获得较多的抗性基因标记条带;在甘蔗常用亲本中,抗性较强和育种效果较好的抗性亲本崖城82-96获得最多的抗性基因标记条带,其次为育种效果较好的两个亲本CP72-1210和F160。这些拥有较多基因组和抗性基因标记条带的材料可用于甘蔗品种的遗传改良。4.使用基因克隆技术,从抗黑穗病和强分蘖的倍性割手密无性系中克隆出抗黑穗病基因GluA1和分蘖基因HTD2的基因组序列,同时使用另外4个甘蔗原始种亲本(热带种(Saccharum officinarum)、大茎野生种(Saccharumrobustum)、印度种(Saccharumbarberi)、中国种(Sacchharum sinense))及甘蔗骨干亲本和甘蔗主栽品种等材料作为对照,共获得1040条克隆序列。序列组成表明,2个基因在所有研究材料中都由2个外显子和1个内含子组成,在序列位点数上,HTD2基因变异要大于GluA1基因。核苷酸多样性表明GluA1基因外 ·显子2序列变异最为丰富,其次为内含子区域,外显子1区域变异较少,相对保守;HTD2基因内含子序列变异最为丰富,其次为外显子1区域,而外显子2区域相对保守;在插入缺失位点数上,GluA1基因较少,而HTD2基因较多。在两个基因编码区多态性上,包含倍性割手密在内的原始种亲本相比较甘蔗骨干亲本和甘蔗主栽品种拥有更为丰富的遗传变异和较多的单倍型。在原始种亲本内,印度种HATUNI、中国种友巴(Uba)的GluA1基因拥有更多的基因多态性,抗黑穗病倍性割手密居中,而热带种黑车里本(Black cheribon)和大茎野生种51NG63在该基因上多态性较低;对于HTD2基因,强分蘖倍性割手密拥有更多的基因多态性,热带种黑车里本和大茎野生种51NG63基因多态性较低。在2个基因的单倍型分布上,抗黑穗病和强分蘖倍性割手密与其它4个原始种亲本及甘蔗骨干亲本和甘蔗主栽品种共有的单倍型较少,表明倍性割手密在抗黑穗病和分蘖性状利用上具有较大的潜力。通过抗感黑穗病和强弱分蘖材料单倍型蛋白质序列的比对,在GluA1蛋白质序列上发现1个变异位点可能与材料的抗黑穗病有关,在HTD2蛋白质序列上发现1个变异位点可能与材料的分蘖有关。


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