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茶叶儿茶素合成相关miRNA及靶基因的验证和表达分析

孙平  
【摘要】:儿茶素是茶叶中重要的次生代谢物,不仅对茶叶的品质形成起着重要作用,而且是茶叶中重要的保健物质。目前,儿茶素已广泛应用于食品、医药及日用品等领域。microRNA是植物基因表达的一类重要调控因子。miRNA参与调控植物器官的形态建成、信号转导、激素应答、逆境胁迫、营养代谢等植物生长发育的各个方面。miRNA对茶树生长发育的作用机理和功能研究逐步发展成为现代茶树研究的新方向。目前关于儿茶素合成调控的研究大多是从环境因素和转录因子角度出发,有关miRNA参与茶树儿茶素生物合成的研究报道较少。本文通过生物信息学和高通量测序获得茶树miRNA序列信息,利用RLM-RACE和降解组测序技术验证miRNA对儿茶素合成相关基因的调控。同时研究了茶树DHD/SDH基因的miRNA鉴定、表达分析,及DHD/SDH在烟草中的干扰表达试验,初步探究DHD/SDH在茶树中功能。主要研究结果如下:1生物信息学鉴定茶树保守miRNA以高EGCG含量的茶树特异资源茶树新品系'1005'转录组文库和miRBase数据库为基础,通过生物信息学方法挖掘茶树中潜在的miRNA序列,获得80个miRNA家族的92个成员。采用qPCR验证miRNA,检测了 31条miRNA在茶树1叶、3叶和老叶中的表达。对miRNA表达模式进行分析,miRNA的表达模式有一致性,但也存在差异。通过qPCR试验检测了 miRNA在不同茶树叶片中的表达水平,这也进一步验证生物信息学预测的可靠性及miRNA的存在。2高通量测序法鉴定茶树miRNA以茶树'1005'混合叶片为样品,利用高通量测序鉴定茶树中保守miRNA,挖掘茶树特异miRNA。通过测序和分析,获得73条保守茶树miRNA,42条茶树新miRNAs。3利用降解组测序鉴定茶树miRNA的靶基因以茶树'1005'混合叶片为样品,构建茶树叶片降解组文库,结合茶树miRNA序列信息和转录组文库分析,共获得miRNA的26条靶基因,共检测到26个降解位点。靶基因主要是转录因子、抗病蛋白、信号转导,其中大部分靶基因与拟南芥同源。利用RLM-RACE验证了 5个miRNA的5条靶基因,与降解组测序得到的结果基本一致。4儿茶素合成相关基因mRNA裂解位点的验证在生物信息学和高通量测序鉴定的茶树miRNA信息基础上,结合NCBI中登录的儿茶合成相关基因序列进行预测,预测结果显示多条miRNA裂解儿茶素合成途径相关基因。利用RLM-RACE法进行裂解位点验证,结果鉴定了 14条miRNA对9条茶树儿茶素合成相关基因的裂解。9条基因为桂皮酸一4-羟化酶(Cinnamate 4-hydroxylase,C4H)、两条查尔酮合成酶(Chalcone synthas,CHS)、查尔酮异构酶(Chaalcone isomerase,CHI)、黄烷酮 3-羟基化酶(Flavanone 3-hydroxylase,F3H)、二氢黄烷醇 4-还原酶(Dihydroflavonol 4-reductase,DFR)、无色花青素还原酶(Leucoanthocyanidin reductase,LAR),及两条花青素还原酶(Anthocyanidin reductase,ANR)。C4H同时被 miR5251 和 miR7777-5P.1 裂解;miR167a 和 miR529d裂解CHI;miR7814同时裂解CHS1和CHS3,产生两个裂解位点;miR5240、miR3444b 和 miR4380a 同时可裂解DFR;miR156g-3p 靶向F3H,试验获得两个裂解位点;miR2868裂解LAR miR5559-5p同时裂解ANR1和ANR2,miR2593e裂解ANR1。另外miR5264和miR7717c-3p裂解靶基因AVR2,且存在多个位点。同时验证过程中发现,靶基因还存在其他潜在剪切位点,说明存在其他未鉴定的miRNA对儿茶素的合成起调控作用。5 miRNA及儿茶素途径相关基因表达与儿茶素积累模式分析对茶树'1005'扦插茶苗进行ETH、24-D、IAA、ABA和6-BA五种外源激素处理,利用高效液相色谱检测叶片儿茶素含量。结果显示ETH、24-D、IAA、ABA和6-BA处理后酯型儿茶素含量变化与儿茶素总量变化趋势一致。在1叶和2叶中下降,老叶中含量升高。非酯型儿茶素含量变化波动较大。在老叶中,激素处理与对照组差异不显著。IAA处理后,1叶中CHI、F3'5'H表达显著上升,PAL、CHS1、F3H、ANS的表达与对照比较呈显著下降;2叶中4CZ1、CHI表达显著上升,仅ANS呈显著下降趋势;老叶中PAL呈显著上升,C4H、4CL2、CHS1、CHS2、CHS3、F3H、DFR、LAR、ANRI、ANR2 呈显著下降趋势。2,4-D处理后,4CZ1和PAL表达有提高外,其它基因表达趋势与儿茶素含量趋势基本一致。ETH处理后,在1叶中,F3'5'H表达显著上升,而PAL、CHS1、CHS2、CHS3、F3H、DFR、ANS表达量显著下降。与对照相比2叶中除CHI显著下降外,其余基因均显著上升。老叶中,PAL、4CL1、CHI、ANS 表达显著上升,CHS1、CHS2、CHS3、F3H、F3 '5 'H、ANR1、ANR2表达呈下降趋势。ABA处理后,1叶中C4H、4CL1、4CL2、CHS1、CHS2、CHS3、CHI、F3'5'H、DFR、LAR、ANR2表达呈显著上升,仅AVS呈显著下降趋势。在2叶中,苯丙烷途径和类黄酮途径的基因表达均呈显著上升。在老叶中,除ANS外其他基因表达均显著下降。6-BA处理下,在1和2叶中,多数儿茶素合成相关基因表达呈显著上升,但也有例外,1叶中F3H和ANS表达差异不显著,2叶中CHI和F3H差异不显著。在老叶中,4CL2、CHS1、HHS2、CHS3、CHI、F3H、DFR、ANR1、ANR2呈显著下降趋势,其他基因差异不显著。采用qPCR检测外源激素处理下miRNA与靶基因的表达模式。miR156g-3p 与靶基因 F3H,miR2868 与靶基因 LAR,miR529d 和miR167a与靶基因CHI表达基本呈负相关,进一步证实miRNA在转录后水平对靶基因起着负调控作用,抑制其表达。DFR同时被miR5240、miR3444b和miR4380a调控。分析三条miRNA的表达模式发现,外源激素处理下三条miRNA表达趋势基本一致。说明miR5240、miR3444b 和 miR4380a 三条 miRNA 共同介导 DFR的转录后水平表达调控。miR7814与靶基因CHS表达并未完全呈负相关,原因可能是同一 miRNA靶向同一家族成员基因,其对不同成员的调控强弱存在差异,另一方面可能是受到多个调控因子调控。ANR、C4H受两条及以上miRNA的调控,miRNA与靶基因的表达并未呈负显著的调控模式。靶基因同时受多条miRNA的调控,不同发育成度叶片或外源激素的刺激时,可能会不启动不同的调控方式,如共同调控靶基因表达,或不同调控因子功能互补。6莽草酸途径3-脱氢奎尼酸脱水酶/莽草酸脱氢酶表达调控及功能研究儿茶素生物合成主要涉及的途径:莽草酸途径、苯丙烷途径、类黄酮合成途径。莽草酸途径是连接初级代谢和次生代谢的重要桥梁。3-脱氢奎尼酸脱水酶/莽草酸脱氢酶(DHD/SDH)是莽草酸中唯一的双功能酶。在获得的茶树miRNA序列的基础上,对本试验室克隆得到的茶树三条DHD/SDH进行miRNA预测和鉴定。获得了 4条miRNA参与裂解CsDHD/SDH。其中 miR5180b、miR1510b-5p 和 miR24 共同靶向CsDHD/SDH2,miR868-5p 作用于CsDHD/SDH3。同时对茶树中三条CsDHD/SDH表达模式进行了检测。不同激素处理下,CsDHD/SDH2 和 CsDHD/SDH3表达模式一致。CsDHD/SDH2 和CsDHD/SDH3的表达模式存在协同作用。CsDHD/SDH1与CsDHD/SDH2和CsDHD/SDH3之间的表达存在负反馈调节,CsDHD/SDH1上调表达时会导致互补基因CsDHD/SDH2和CsDHD/SDH3下调表达。为进一步分析茶树CsDHD/SDH功能,我们构建了茶树CsDHD/SDH1干扰载体,并转化至烟草中,获得了 T1代阳性转基因植株。通过荧光定量检测分析显示CsDHD/SDH1干扰载体表达后导致烟草自身NtDHD/SDH1表达下调,但促使烟草自身NtDHD/SDH2表达上调。同时T1代转基因烟草类黄酮含量降低。说明DHD/SDH1在植物的类黄酮的合成中具有重要作用。


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