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《福建农林大学》 2014年
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花生维生素E合成相关基因的克隆及HPPD基因的功能鉴定

张福婷  
【摘要】:维生素E(VitaminE)是一种对动植物都具有重要作用的脂溶性抗氧化剂,只能在光合生物如绿色植物和光合细菌中合成。维生素E是人和动物体中重要的营养元素,因此必须通过食物或其他方式来保证足够维生素E的补充。植物油是人体摄取维生素E的主要来源,花生是重要的油料作物,花生油是主要食用油之一。为了了解花生中维生素E的代谢机制并最终提高花生中维生素E的含量和活性,本研究对维生素E(α-生育酚)的合成场所及在花生胚发育过程中的积累模式进行了初步分析。首次从花生中克隆了维生素E合成途径相关酶基因牻牛儿基牻牛儿二磷酸合酶基因(GGDS)、牻牛儿基牻牛儿二磷酸还原酶基因(GGDR)、预苯胺酸脱氢酶基因(ADH)和对羟苯基丙酮酸双加氧酶基因(HPPD),并分析了它们的结构特征、表达状况和进化演变。将克隆的HPPD基因通过农杆菌介导转入翠碧一号和本氏烟草中鉴定基因功能,判断HPPD酶在花生生育酚合成中是不是限速酶,获得了 T0代阳性转化植株。取得的主要研究结果如下:1利用发根农杆菌介导翠碧一号烟草产生发状根,采用直接溶剂萃取法提取发状根和正常生长的根组织中的α-生育酚,经RP-HPLC检测发现翠碧一号正常根中α-生育酚的含量为19.29±2.1μg/g,而发状根中未检测到α-生育酚的存在。进一步论证了 α-生育酚合成的需光性。2提取闽花6号花生胚发育不同时期的α-生育酚,经RP-HPLC检测后发现闽花6号胚发育过程中α-生育酚的含量变化呈现一定规律性,最明显的特征是花生20天胚中α-生育酚的含量达到最高,从10天胚到20天胚的2.6倍迅速增长,至20天胚到30天胚的1.2倍回落,之后进入40、50和60天胚的稳定变化期。3采用改良的RACE技术,从闽花6号花生中克隆并分离了GGDS\GGDR、ADH基因,分别命名为AhGGDS、AhGGDR、AhADH。AhGGDS全长 cDNA 序列长为1,596bp,ORF长为1,026bp,编码341个氨基酸。AhGGDR全长cDNA序列长为1,573bp,ORF长为1,119bp,编码372个氨基酸。AhADH全长cDNA序列长为1,155bp,ORF长为810bp,编码269个氨基酸。Blastn比对表明,克隆所得的AhGGDS、AhGGDR、AhADH基因序列均与大豆的该基因序列有较高的一致性。多序列比对以及进化树构建表明,AhGGDS、AhGGDR、AhADH与其他植物的该蛋白序列高度同源,进化上均与大豆为同一分支。qRT-PCR分析表明:(1)AhGGDS在胚中的表达量远高于其他组织,且随着胚发育成熟表达量明显下降;(2)AhGDR在叶中的表达量远远高于其他组织,且随着胚发育成熟表达量在60天胚时显著下降;(3)AhDH在胚中的表达量远远高于其他组织,且随着胚发育成熟表达量在40天胚时上调1.7倍,60天胚时下调5倍。闽花6号花生表达谱芯片分析表明:AhGGDS和AhGGDR在不同激素处理和低温干旱胁迫下表达量均轻微下调;AhADH在不同激素处理下的表达水平变化不大,但在响应低温和干旱胁迫下的AhADH的表达水平差异较大,表现为低温胁迫上调30%,干旱胁迫下调33%。4从闽花6号克隆并分离了HPP 基因,命名为AhHPPD该cDNA序列全长为1,575bp,ORF长为1,323bp,编码440个氨基酸。Blastn比对表明,AhHPPD基因序列与其他植物的HPPD有较高的一致性。多序列比对以及进化树构建表明,AhHPPD与其他植物的HPPD高度保守,进化上与大豆为同一分支。从栽培种闽花6号和两个野生种花生的基因组DNA中扩增获得HPPD基因组序列,进行核酸序列比对并构建进化树,表明闽花6号HPPD的两个拷贝均来源于野生种A.ipaensis(BB)。对从闽花6号中获得的AhHPPD的gDNA和cDNA序列比对发现,该gDNA片段包含两个外显子和一个位于1181-1429bp,长度为248bp的内含子。qRT-PCR分析表明,AhHPPD在果针中的表达量最高,且随着胚发育成熟表达量明显下降。闽花6号花生表达谱芯片分析表明,AhHPPD在不同激素处理下表达量变化均不明显,在低温干旱胁迫下表达量明显上调。构建过量表达载体35S::AhHPPD转化翠碧一号和本氏烟草,HPLC检测阳性植株叶片中α-生育酚的含量较野生型提高2-3倍。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S565.2;Q943.2

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