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《福建农林大学》 2015年
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鸭坦布苏病毒RT-PCR检测方法的建立及E蛋白的原核表达

温亚萍  
【摘要】:目的:2010年4月以来,我国鸭主产区的种鸭、蛋鸭爆发一种新的传染病。感染鸭的主要症状为高热、食欲下降甚至废绝、拉黄绿色稀粪、产蛋下降甚至停止,部分病鸭出现神经症状和运动障碍。现该病病原已确定为鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV),该病已造成养鸭业的巨大经济损失。为预防该病并及早对疾病做出诊断,有必要建立一种敏感、特异的诊断方法。此外,E蛋白是DTMUV的结构蛋白,具有较强的抗原性,对DTMUV的诊断、疫苗研发等具有重要的意义。方法:试验一:根据GenBank发布的DTMUV E基因的保守序列设计1对特异性引物,扩增目的片段大小为1020 bp。对RT-PCR反应体系中的退火温度进行优化,从中选择最优的反应条件,用优化过的RT-PCR检测方法对6种不同的禽类病毒进行检测,确定该检测方法的特异性。同时,将DTMUV阳性尿囊液做10倍梯度的倍比稀释,采用上述优化好的RT-PCR检测方法确定其敏感性。用该检测方法对病毒的阳性样品进行组间与组内试验,确定该方法的稳定性与重复性。最后对临床疑似病例的粪便、泄殖腔拭子、血液等进行检测,确定该诊断方法是否适用于临床活体的早期检测。试验二:根据E蛋白主要抗原结构域的基因序列设计1对特异性引物,对DTMUV E基因进行扩增,扩增产物与pET32a(+)表达载体进行连接,构建重组表达质粒,转化至BL21(DE3)感受态细胞。挑取重组质粒,经PCR、酶切、测序鉴定,确定载体构建成功。对IPTG诱导浓度与诱导表达时间进行优化,确定最优的诱导表达条件。经SDS-PAGE电泳分析重组蛋白。以抗DTMUV13阳性血清为一抗,兔抗鸭IgG为二抗,Western blot法验证该重组蛋白是否正确。结果:试验一:试验结果表明,所设计的引物能够特异性扩增出1020 bp片段,测序结果表明,该片段为目的片段。退火温度优化结果显示54℃为最优的退火温度。特异性试验结果表明,仅DTMUV能被扩增出1020 bp目的条带,而其他5种病毒均未能扩增出目的片段,表明该方法特异性强。敏感性试验结果表明,该方法最低的核酸检出量达到967.5×10-7ng/μL,敏感性高。重复性试验结果表明,该方法具有可重复性。对87份临床疑似病料进行检测,检出阳性样品40份,与乳胶凝集诊断方法符合率达72.49%。对病鸭粪便、泄殖腔拭子、血液各30份进行RT-PCR检测,阳性率分别为33.33%、36.67%、26.67%,表明该方法也可用于活体检测。试验二:结果表明,本试验所设计引物能够特异性扩增1020 bp目的条带。用T4DNA连接酶对E基因片段及表达载体进行连接,构建重组表达质粒,转化感受态细胞,PCR鉴定结果显示,能特异性扩增出1020 bp目的片段。酶切鉴定和测序结果进一步表明,本试验成功构建了 pET32a(+)-E原核表达载体。诱导重组蛋白表达的条件优化结果显示,最佳的IPTG诱导浓度为1.3mmol/mL,最佳的诱导时间为8 h。SDS-PAGE分析结果可知,重组蛋白主要以包涵体形式存在。对重组蛋白进行纯化,结果显示80mM的咪唑对蛋白的洗脱效果最好,能够得到目的蛋白。Western blot结果表明重组E蛋白被正确表达,且具有良好的免疫原性。结论:1、本试验成功建立了 DTMUVRT-PCR检测方法,该方法敏感性强,稳定性良好,可用于DTMUV病的临床诊断和分子流行病学调查。2、本试验成功构建了 DTMUVE蛋白的原核表达载体,并成功诱导其在体外的表达,该结果为进一步阐明该病的致病机理,基因工程疫苗的研究奠定基础。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S852.65

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