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枳砧‘红绵蜜柚’嫁接不亲和机理研究

何文  
【摘要】:'红绵蜜柚'[Citrus grandis(L.)Osbeck cv.'Hongmian Miyou']是由'馆溪蜜柚'芽变选育而成的新品种(闽认果2011008;川审果2016016),因其海绵层呈浅红色、质地较柔软、风味浓郁而深受消费者喜爱。课题组将具有育种潜力的10余份琯溪蜜柚芽变株系引种至四川柑橘产区,经多年多点试验示范、田间调查和品质分析显示,'红绵蜜柚'在四川柑橘产区品种特性遗传稳定,投产早、丰产性优异,成熟期较原产地福建平和晚2个月,从11月中旬至元旦前后均可留树,延长了蜜柚在国内的鲜果供应期,具有较高的商品价值和推广价值。但课题组在引种试验过程中发现,枳[Poncirus trifoliata(L.)Raf.]作为四川柑橘产区'琯溪蜜柚'栽培常用砧木,其嫁接体生长、结果性状表现良好,而枳砧'红绵蜜柚'初期生长势良好,从嫁接当年夏季开始植株逐渐黄化死亡,导致了巨大的经济损失。经多地多次嫁接试验,排除病虫害、肥水管理及气候因素,确认枳砧'红绵蜜柚'黄化属于嫁接不亲和引起。嫁接是柑橘植株进行繁殖的主要方法,枳砧'红绵蜜柚'嫁接不亲和现象限制了该优新蜜柚品种在生产上的推广利用。红绵蜜袖属于馆溪蜜柚芽变品种但枳砧'红绵蜜柚'幼苗期出现砧穗不亲和现象,是研究多年生木本植物嫁接不亲和机制的优良材料。针对枳砧'红绵蜜柚'不亲和机理的研究具有重要意义。因此,本研究以枳砧'红绵蜜柚'(Hm/Pt)为实验组,枳砧'琯溪蜜柚'(Gx/Pt)和香橙砧'红绵蜜柚'(Hm/Cj)为对照嫁接组合,对3个组合的田间生长指标和生理生化指标进行了观测,并对3个嫁接组合3个关键发育时期进行了转录组测序,筛选出亲和/不亲和嫁接组合叶片在不同发育时期的差异表达基因,克隆并分析唯一的差异转录因子CgWRKY27基因及启动子序列,以期探索枳砧'红绵蜜柚'嫁接不亲和机制。主要研究结果如下:1、观测并记录了亲和/不亲和嫁接组合植株的生长量及形态特征,结果显示3个砧穗组合春梢及夏梢的生长量都没有显著差异。嫁接后404天,枳砧'红绵蜜柚'嫁接苗净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、叶肉羧化效率明显低于2个对照组合。3个嫁接组合的叶绿素含量变化趋势一致,但枳砧'红绵蜜柚'在整个试验期间的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素显著低于对照组合。对叶片含水量以及水势测定表明,整个生长发育期内,亲和嫁接组合水势变化趋势一致,而枳砧'红绵蜜柚'水势则是持续降低。枳砧'红绵蜜柚'的蔗糖和果糖含量显著高于对照组合,葡萄糖含量在嫁接后404天时没有显著差异,可溶性糖总量为65.51 mg.g-1 FPW,分别为香橙砧'红绵蜜柚'的1.35倍和枳砧'琯溪蜜柚'的1.17倍。嫁接结合部解剖学观测,亲和/不亲和组合之间的解剖结构没有差异。田间表现和解剖观察结果显示,嫁接亲和与不亲和组合具有相同的愈合过程,枳砧'红绵蜜柚'不亲和由于砧穗物质运输及信号传递的不正常造成的。2、运用高效液相色谱仪及原子分光光度计,对亲和/不亲和嫁接组合不同发育时期叶片内源激素和矿质营养成分进行测定。结果表明,枳砧'红绵蜜柚'叶片除嫁接后404天时的镁元素存在过量现象(0.091 g.kg-1FW),其余大量元素及微量元素均处于适宜范围。内源激素测定结果显示,在嫁接后404天时,枳砧'红绵蜜柚'ABA含量显著高于对照嫁接组合,枳砧'红绵蜜柚'的GA3含量处于中等水平,但都有显著低于对照组的时刻。枳砧'红绵蜜柚'叶片IAA含量前期较高,但在测定阶段后期都显著低于对照组(0.0028~0.0046mg.g-1 FW),结合前人研究,我们认为IAA在枳砧'红绵蜜柚'不亲和黄化过程中起关键作用。3、为了解亲和/不亲和嫁接组合转录水平差异,本试验分析3个嫁接组合3个关键发育阶段转录水平的差异。综合分析后,筛选出与嫁接亲和性相关的途径有叶绿素合成途径、信号转导途径以及内源激素合成途径。进一步对转录组数据分析,共筛选出7个显著差异表达基因,并分析出1个差异表达的WRKY转录因子。4、克隆并分析了差异表达的红绵蜜柚Cg-hmWRKY27和繪溪蜜柚Cg-gxWRKY27基因及其启动子序列,并对其特异性表达进狞初步探究。氨基酸序列比对和进化树分析结果表明,CgWRKY27蛋白与克里曼丁橘的蛋白同源性最高。Cg-/hmFWRKY27基因在各个组织中均有表达,其中在红绵蜜柚海绵层中表达量最高,果肉表达量最低。生物信息学分析预测Cg-gxWRKY27基因的调控序列可能存在1个核心启动子区,位于249~299之间,分值为0.83,可能的转录起始位点为位于290的A;Cg-hmRKY27基因的调控序列可能存在1个核心启动子区,位于250~300之间,分值为0.96,可能的转录起始位点为位于291的T。启动子顺式作用元件分析表明具有脱落酸(ABA)、乙烯(ethylene)和茉莉酸甲酯(MeJA)响应元件以及厌氧诱导和防御胁迫响应元件。


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