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《福建农林大学》 2019年
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全局调控因子McrA调控下的Aspergillus niger CBS 513.88的表型及次级代谢产物研究

李执  
【摘要】:真菌是自然界中常见的一类微生物,因其能合成多种活性小分子化合物而广为人知。自从发现青霉素以来,更多的真菌活性产物陆续被挖掘。黑曲霉是一种常见的丝状真菌,因工业化发酵柠檬酸而广受关注,在其发酵产物中也鉴定了葡萄糖酸和富马酸。分析野生型菌株Aspergillus niger CBS 513.88的基因组,发现其包含几十种次级代谢基因簇,但从中鉴定的化合物远少于预期值,说明Aspergillus niger CBS513.88中隐藏着大量沉默基因簇,它有生产多种天然产物的潜能。研究发现改变转录因子的调控机制能激活沉默基因簇的表达或者提高相应化合物的产量,这也为进一步挖掘新型活性天然产物提供了重要思路。真菌中存在一类全局调控因子McrA,敲除mcrA激活构巢曲霉、青霉菌和土曲霉中的沉默基因簇。本课题以全局调控因子McrA为切入点,利用分子生物学技术,通过敲除mcrA来进一步激活沉默基因簇或者提高相应化合物的产量。首先利用潮霉素抗性基因(hph)作为筛选标记,成功构建Aspergillus niger CBS 513.88 mcrA的突变株。其次,为了验证敲除型与野生型菌株对高盐高渗压力和重金属离子的敏感性,选用了一系列培养基来同批次培育两种菌株。同时利用液相、质谱及核磁等手段对突变株中的产物进行了分离纯化与结构鉴定,并对突变菌和野生型中的几种化合物进行了定量分析。结果显示,敲除mcrA的菌株对高盐高渗压力的敏感性增加,对重金属离子的敏感性降低,同时菌落变为黄色。以野生型为阴性对照,我们在突变菌中成功分离与鉴定了3种化物,化合物1、2和3分别为(3S,8R)-8-hydroxy-3-carboxy-2-methylenenonanoic acid、(3S)-9-hydroxy-3-carboxy-2-methylenenonanoate、asperitaconic acid A。通过对化合物的定量分析结果显示,与野生型相比较,突变株中化合物1产量增长了29.9%,化合物2的产量提高约6.47倍,但是化合物3产量显著减少。这些结果显示mcrA的敲除可能激活了黑曲霉中多个基因的转录,从而正向调控了1和2的合成。本课题成功的在黑曲霉中首次构建了mcrA的敲除菌株,并提供了部分产物的表达量,为同类型课题的研究提供了新方向。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R915

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