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《福建农林大学》 2019年
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鱼精蛋白增强大肠杆菌疫苗诱导早期免疫保护的研究

娄欣宇  
【摘要】:致病性大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)可感染人和其他多种动物,新生和幼龄动物更为易感,临床上多表现为急性传染病。当前,致病性大肠杆菌已对大部分抗菌药物产生耐药性,给药物防治E.coli感染带来很大困难。现阶段养殖场防控大肠杆菌病主要依靠疫苗接种,但现有的疫苗存在副作用大,诱导免疫保护慢,以及免疫效果不理想等问题。因此,通过添加佐剂来提高E.coli疫苗的免疫效力具有重要临床意义。鱼精蛋白(Protamine protein,PP)是一种主要存在于鱼类成熟精子细胞核中的碱性蛋白质,广泛应用于心脏手术、抗血栓、抗肿瘤、食品防腐和抗原载体等方面。本实验室前期研究证明,PP能极显著地增强E.coli疫苗诱导的早期体液免疫反应和免疫保护,具有良好的临床应用潜力。为了进一步探讨PP增强E.coli的佐剂作用及其机制,本文从以下四部分展开试验探究。1.研究PP对E.coli疫苗免疫效力的增强作用方法:24只雌性ICR小鼠随机分为3组,分别皮下注射E.coli灭活疫苗(1×10~7 CFU/只)(下同)、PP(100μg)+E.coli灭活疫苗和生理盐水。3d后对所有试验小鼠腹腔注射致死剂量E.coli菌液(含活菌1×10~7 CFU),记录发病情况及死亡率。结果:PP作为佐剂与E.coli疫苗联合免疫小鼠,使小鼠存活率从12.5%提高至87.5%,显著提高了疫苗诱导的早期免疫保护作用。2.研究PP增强E.coli灭活疫苗诱导早期免疫保护的机制方法:32只雌性ICR小鼠随机分为4组,分别皮下注射E.coli灭活疫苗、铝胶(200μg)+E.coli灭活疫苗、PP(100μg)+E.coli灭活疫苗和生理盐水。3d后对所有小鼠腹腔注射亚剂量E.coli菌液(含活菌2×10~6 CFU),记录发病情况及死亡率,并检测免疫后48h特异性抗体水平,攻毒后血液细菌含量和血常规。结果:PP组攻毒保护率为100%,与空白组(50%),铝胶组(25%)和对照组(37.5%)存在极显著差异(P0.01)。免疫后48h,PP即可诱导机体产生相对较高的特异性IgM、IgG抗体水平。在攻毒后可以促进机体对细菌的清除作用(P0.05),提高血液循环中PLT的数量(P0.01),缓解WBC、LYM~#及GRAN~#的减少(P0.05)。表明PP作为佐剂在E.coli疫苗免疫后2d即可激活机体的早期免疫应答,推测是通过增强固有免疫功能和快速产生较高水平的特异性抗体来增强机体对E.coli攻毒的保护力。3.研究PP的抗大肠杆菌攻毒作用与TLR4信号通路的关系方法:(1)选取雌性ICR小鼠进行试验,皮下注射PP(100μg)或生理盐水。7d后分别腹腔注射致死剂量和亚致死剂量的E.coli菌液,记录致死剂量攻毒后48h的发病情况和死亡率,检测亚致死剂量攻毒后小鼠血液LPS浓度,血液ALT浓度以及炎症因子表达水平,另取8只未经处理的小鼠,处死后取样作为空白组。(2)24只雌性ICR小鼠随机分为2组,分别皮下注射PP(100μg)和生理盐水。于给药后2d、7d每组各取一半小鼠处死,检测PP对TLR4通路相关的细胞因子mRNA转录的影响。结果:(1)PP单独注射(7d)能使小鼠存活率从0%提高至80%,表明PP有明显的抵抗E.coli侵袭的作用。PP可以降低E.coli攻毒后小鼠血液LPS浓度和ALT浓度,下调TLR4、NF-κB、IL-1β、IL-6、IRF7、IFN-β等因子的mRNA转录水平,推测PP对MyD88依赖和TRIF依赖两条TLR4信号通路启动途径均具有一定的抑制作用,避免机体发生早期急性感染时其炎症反应的过度发展和免疫紊乱的发生。(2)PP单独注射7d后,可检测到TLR4、IFN-β、IL-6的mRNA转录水平出现一定程度的上调,推测PP可能通过事先轻度促进机体的炎症反应来增强对E.coli的抵抗力。4.研究PP增强E.coli疫苗诱导家兔早期免疫保护作用方法:将12只家兔随机分为2组,分别皮下注射E.coli灭活疫苗(3×10~7 CFU/只)和PP(100μg)+E.coli灭活疫苗。7d后对其皮下注射E.coli菌液0.6mL(含活菌3×10~7 CFU),记录发病情况及死亡率。另取6只未经处理的家兔作为空白组,一同检测血常规、血液LPS含量和血生化。结果:PP联合E.coli灭活疫苗免疫家兔能够使血液PLT和WBC数量有一定程度提高;与对照组相比,攻毒后PP组能极显著降低攻毒所致的LPS、ALT和AST的升高,缓解攻毒所致的PLT、WBC数量的下降。表明PP作为佐剂与E.coli疫苗联合免疫家兔,可以有效增强其免疫效力。综上所述,PP作为E.coli疫苗佐剂,可以快速激活机体早期免疫反应和免疫保护。机理研究表明,PP具有一定的免疫调节作用,它能快速增强小鼠对E.coli的抵抗力,这可能与调控LPS-TLR4信号通路相关炎症因子表达相关。因此,PP作为大肠杆菌疫苗候选佐剂,具备潜在的临床应用价值。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:S852.4

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