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禽流感病毒(H5N1)基因(h5n1a)在马铃薯中的转化与表达研究——附:乙肝表面抗原(HBsAg)基因转化的对比研究

杜海莲  
【摘要】: 本研究首次将禽流感病毒(H_5N_1)基因h5n1a导入马铃薯获得 表达,并优化了转化系统,为商品化生产转基因植物疫苗提供科 学依据。 1、为了优化马铃薯(Solanum tuberosum L.)以块茎为受体 的再生系统。着重对诱导分化和结薯培养基作了较系统的筛选。 以MS为基本培养基,调整激素配比,得到M1、M2、M3、M4等4 种培养基。比较试验结果以M4(MS+2.0mg/L BA+3.0mg/L ZT+0.5mg/L NAA+0.5mg/L GA_3)诱导块茎分化的效果最佳,丛芽分化频率达89.4%, 分化时间提早约20天。同时筛选了诱导结薯的较优培养方法,获 得使试管薯结薯数增加近1倍的壮苗和诱导结薯培养基组合(壮 苗:1/2MS+0.5mg/L BA+0.5mg/L GA_3+3%Suc;诱导结薯:MS+2.0mg/L BA+3.0mg/L ZT+10%Suc),为获得高频转化奠定了基础。 2、构建了4个植物表达双元载体。p1301BG含有增强型绿色 莹光蛋白基因egfp;p1301BΩG在egfp与35s启动子之间插入65bp 的增强子序列Ω因子;p1301H5N1含有禽流感病毒基因h5n1a; p1301HBs含有乙肝表面抗原基因HBsAg。这4个载体均以35s为 真核表达启动子,报告基因和目的基因以Tnos为终止子、植物筛 选标记基因以35s PolyA加尾,融合成嵌合基因。原核抗性为Kan。 分别用直接法导入农杆菌EHA105、LBA4404和AGL1。 3、初步比较了ZHFQ-2型火药式基因枪与农杆菌的转化效果, 发现,该基因枪微弹分散性差,转化结果不稳定,对受体材料损 伤较大,未能筛选到转化株;而农杆菌转化相对较稳定,并初步 发现外源基因的瞬时表达大多集中在受伤和形成层部位。 4、对农杆菌转化条件的比较研究发现,菌株、菌体状态、稀 中文摘要 释度以及真空、激素和AS处理,均对转化有很大影响。对3个菌 株(LBA4404、EHA105和AGLI)的侵染性比较发现,用EHA105转化 马铃薯块茎,GUS瞬时表达效果更好;比较几种转化条件下的GUS 瞬时表达结果,筛选到可获得高且稳定的GUS瞬时表达的转化条 件:菌体用 Mg(MS+0.sing/L GA3+10umol/L AS)液体培养基稀释 4倍,与受体于28oC、100rpm振荡侵染20-30min,共培养时在分 化培养基上加 30卜 mol/L AS(乙酚丁香酮),16hr弱光照共培养 3d, 使GUS瞬时表达活性提高了3.4倍。 5、在进行抗生素基础抗性测定和转化体筛选时,比较马铃薯块茎 对Hgg和Kan两种筛选剂的敏感性,发现马铃薯块茎受体对Hnn更 敏感,因此选用Hgg为抗性筛选剂。在此基础上改进了筛选策略, 提出间段压力筛选法。该方法与常规的连续压力筛选法相比,大 大减低了基础抗性确定的主观性对转化效率的影响。使获得抗性 株的频率提高了82儿外源基因阳性率提高了2.4倍,获得转化株 的时间提早7-10天。 6、获得 HSNI转基因马铃薯株系 31个,并对其外源基因的整 合和表达做了系统检测。GUS表达活性结果表明,外源基因己插入 马铃薯基因组并得到表达,但株系间差异较大,说明外源基因整 合的随机性。用hsnla双引物扩增马铃薯基因组总DNA,得到与 目的基因大小一致的特异性片段。以DIG标记的hsnla探针进行 Southern杂交,进一步证实基因hsnla已整合到马铃薯基因组中, 且初步确定为单拷贝插入。 7、用HSNI 鼠单抗与马铃薯块茎蛋白粗提液进行抗原抗体反 应证实,在马铃薯中表达的外源基因具有抗原抗体反应活性,这 是禽流感病毒(HSNI)基因首次在植物中的表达。由于禽流感病 2 禽流感病毒(HSNI)基因(hjnla)在马铃薯中的转化与表达研究 毒m)是新病毒株,最近才得到其鼠的单克隆抗体,还末能 进行定量检测,以及动物免疫实验结果检测。 8、为了证实所建立的转化系统的有效性,本研究同时进行了 乙肝表面抗原*BSAg)基因在马铃薯中的表达研究,并对结果做 了详细报道。在马铃薯中表达的乙肝表面抗原,经乙肝抗原检测 试剂合检测,具有较强的抗体结合活性,且初步测定表达的抗原 蛋白最高占马铃薯可溶性总蛋白的0.34“ 9、本试验虽然获得了预期结果,但对转基因马铃薯作为疫苗 的动物试验,以及遗传稳定性等试验等尚需时日,无法进行。虽 然我们同时进行了乙肝表面抗原基因HbsAg-s的转化试验,以检 验所设计的技术路线的有效性。但为了实现商品化的植物疫苗生 产目的,尚需进一步研究解决取材、方法、转化、筛选和检测等 一系
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