甘薯抗蔓割病突变体的离体筛选及几丁质酶基因导入研究

【摘要】： 以甘薯无菌苗的叶片作外植体，对四个品种进行适宜培养基的筛选，分别 得到较高再生频率的培养基。在此基础上，进一步研究了叶片的部位和培养基 添加AgNO_3、ABA对再生率的影响，确立了四个品种的叶片高频再生技术体 系，即以带叶柄和中脉的基部叶片为外植体，夏引一号、新种花诱导和植株再 生的培养基均为MS＋NAA 1mg/l＋6BA 0.1mg/l＋AgNO_3 2mg/l，芽分化时间达90 天。金山25诱导培养基MS＋KT 0.5mg/l＋2,4-D 0.5mg/l＋AgNO_3 2mg/l，芽分化 培养基为MS＋AgNO_3 2mg/L，分化时间60天。金山57诱导培养基MS＋NAA 2mg/l＋6BA 0.1mg/l＋AgNO_3 2mg/l，植株再生培养基MS＋0.5mg/L IAA＋0.5mg/L KT＋AgNO_3 2mg/l，分化时间90天，上述四个品种再生率在70％～86％之间。 甘薯蔓割病病原菌的粗毒素致病效果与孢子悬浮液致病效果基本一致，高 压灭菌会导致粗毒素活性部分丧失，粗毒素对愈伤组织、根、芽致死浓度分别 为20％、15％、10％。利用粗毒素对甘薯叶盘培养进行愈伤组织的筛选和全程 筛选比较，结果表明，愈伤组织长时间的筛选会导致分化能力丧失，而全程筛 选有3种筛选方式都获得了再生植株，其再生率为3.3％～18.5％，病指改良效 果以新种花最优，有3个再生株系均达到了中抗水平。对这3个株系的RAPD 检测表明，甘薯突变体在基因组DNA水平发生了变异，且与亲本的基因组相 似率很高。 甘薯的离体转化试验程序研究表明，甘薯叶盘的离体培养中，Kan对愈伤 组织、根、芽完全抑制浓度分别为75mg/l，50mg/l，30mg/l。羧苄青霉素300mg/l＋ 头孢霉素250mg/l为较适宜的抑菌浓度。预培养3天，感染时间9min，共培 养3天，能够明显的提高转化植株的再生效率。通过上述体系获得了35株抗 Kan的植株，对此进行PCR和PCR-southern杂交检测，证明有3个株系的基 因组里整合了Chi和Glu基因，再生植株转化率为8.1％。