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《福建农林大学》 2001年 博士论文
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抗线虫基因表达载体质粒构建和遗传转化研究

陈平华  
【摘要】: 本研究围绕抗线虫基因的遗传转化展开,主要内容包括:1.植物表达载体的 构建;2.农杆菌介导的遗传转化试验;3.基因枪法遗传转化研究;4.抗性植株的 分子鉴定。 提取克隆载体P1832,用NcoI酶切,经klenow补平,再经SacI酶切, 切下完整的基因片段,然后用低熔点胶电泳,回收小片段;提取表达载体 pBI121,用SmaI和SacI双酶切,用低熔点胶电泳,回收大片段;pBI121大 片段和P1832小片段按1:3的浓度比混合,用T4 DNA ligase连接,11℃保 温16-18小时后,反应液直接转化E.coli感受态细胞,在含K100mg/L的LB 固体培养基上涂板,在设立对照的情况下,对长出的抗性单菌落提取质粒进 行酶切鉴定,对正确的重组子取名为pBI1812/DH5α并进行扩增,提取质粒 转化农杆菌Agrobacterium LBA4404,对抗性单菌落进行直接PCR鉴定,获得 pBI1812/LBA4404农杆菌株,含35s启动子,用于对双子叶植物材料的遗传 转化试验。 同样的方法,提取克隆载体P1832,用NcoI酶切,经Klenow酶补平, 再经SacI酶切,切下完整的基因片段,然后用低熔点胶电泳,回收小片段; 提取表达载体pBIL-2,用KpnI酶切,经T4 DNA polymerase补平,再经SacI 酶切,低熔点胶电泳回收大片段;pBIL-2大片段和P1832小片段按1:3的 浓度比混合,用T4 DNA ligase连接,同样直接转化E.coli感受态细胞并涂 板,提质粒鉴定、扩增、转化农杆菌,经鉴定获得pBI18-2/LBA4404农杆菌 株,含Ubi启动子,用于单子叶植物的遗传转化试验。 取甘蔗高产、高糖商业品种ROC16、福农93-3608的梢部,在超净工作 台上取心叶,横切为厚2mm左右的圆片,接种于MS+3mg/L 2,4-D的固体培 养基上,25℃,暗室内诱导愈伤组织;取生长良好的胚性愈伤组织,在MS+BA 2mg/L+NAA0.1mg/L+CaCl2 4.4g/L的培养基上预培养2天,用含100μmol/L Acetosyringone(Aldrich)固体培养基上共培养3天,然后诱导筛选抗性愈伤组 织,最后分化成苗。再取甘蔗胚性愈伤组织,选择2mm3大小的颗粒20-30 粒,用基因枪PDS-1000/He轰击,选择抗性愈伤组织分化成苗;取大豆无菌 苗,取子叶节,用农杆菌PmyBA44M侵染;对大豆愈伤组织用基国枪 轰击,然后在培养基 1/2 MS+BA 0.sin+/L+IBA 0*sing/L+Cef250mg/L+ K刃mg/L上筛选诱导芽丛。 用微量提取DNA的方法提取抗性苗 DNA,经NR检测,获得T PCR 阳性甘蔗黄化苗3株;大豆早熟1号子叶节经农杆菌侵染后获得抗性再生苗。


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