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《福建农林大学》 2002年
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荔枝(Litchi chinensis Sonn.)基因枪转化系统的建立与优化研究

桑庆亮  
【摘要】: 本研究以从荔枝(Litchi chinensis Sonn.)“下番枝”品种幼胚诱导并长期继代保持的胚性愈伤组织(Embryogenic Calli 简称EC)为试验材料,采用基因枪法进行荔枝EC转化系统的建立与优化研究。主要试验结果如下: ①优化了荔枝体胚发生条件,建立了荔枝EC高效再生系统。在附加5mg.L玉米素(ZT)的高糖(6%蔗糖)高琼脂(1.0%)MS培养基上诱导荔枝体胚高频率(100%)形成;在附加10%椰子汁(CW)的高糖(6%蔗糖)的MS培养基中诱导体胚正常成熟并在无激素MS培养基中诱导体胚萌发。 ②建立了荔枝基因转化的适宜受体系统。采用生长量测定的方法确定了继代培养5-10d的荔枝EC处于快速生长分裂期,适宜用作遗传转化受体;采用生长量测定结合定性观察的方法测定了荔枝EC对卡那霉素和潮霉素的敏感性,发现荔枝EC对卡那霉素不敏感,而潮霉素对荔枝EC有致死效应,且显著抑制其增殖,并确定50mg/L为筛选工作浓度。 ③确定了采用基因枪轰击荔枝EC的最佳条件。以含有标记基因gus和潮霉素抗性基因hpt的质粒pCAMB101301,采用基因枪轰击的方法转化荔枝EC,并对轰击条件进行了优化。结果表明,选择预培养5-10d的荔枝EC,轰击前用附加甘露醇0.25mol/L的高渗培养基前处理4h,质粒DNA用量为1.0μg/枪,金粉用量为10μl/枪,在氦气压力为1100psi、轰击距离为6cm条件下轰击1次,并在轰击后在同一高渗培养基上后高渗处理16h,可以获得GUS瞬时表达的最佳效果。 ④建立了荔枝抗性愈伤组织筛选、体胚发生、再生植株与转基因检测的技术体系。采用附加50mg/L潮霉素的筛选培养基对轰击后的荔枝EC筛选,共获得大约80个抗性细胞系,经进一步筛选和对培养条件的优化,保留了7个抗性细胞系(其中4个稳定表达GUS),经PCR检测,gus和hpt基因已整合进荔枝基因组;以所保持的抗性细胞系为试验材料进行体胚发生和再生植株的研究,共获得了再生植株30余株,其中20株来自稳定表达GUS的抗性细胞系,经GUS组织化学检测为转基因植株,其余来自不表达GUS的抗性细胞系,经检测为不表达GUS的植株。 此外,本研究还采用根癌农杆菌感染的方进行了荔枝EC转化的初步研究,经筛选共获得了4个抗性细胞系,最终2个得以保留并获得表达GUS的转基因植株。 本研究对转基因技术在荔枝品种改良上有重要意义,并为今后的荔枝转基因研究的发展提出了问题。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:S667.1

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