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《福建农林大学》 2002年
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食用菌抗病毒蛋白的特性、基因克隆与表达

付鸣佳  
【摘要】: 采用离子交换柱DEAE-SepharoseFF和凝胶层析柱Superdex75 Prep Grade和SephacrylS-200 High Resolution,可从杏鲍菇(Pleurotus eryngii)干样中分离得到多个蛋白组分,经枯斑寄主检测,发现多个蛋白组分都有抗烟草花叶病毒(Tobacco mosaic Virus,TMV)的活性,对TMV的抑制率均在70%以上,高者可达99%。其中xb68Ab已得到了纯化,分子量约为23.7 kDa,在心叶烟和苋色藜上它对TMV侵染的抑制率分别达到99.43%和98.9%。 采用阴离子交换柱DEAE-sepharoseFF和凝胶层析柱Sephacryl S-200 High Resolution从新鲜食用菌榆黄蘑(Plearotus citrinopileatus)中进行了抗病毒蛋白的纯化,结果获得了一个纯化蛋白YP46-46,经SDS-PAGE可确定其分子量为27.4 kDa。以半叶法在枯斑寄主心叶烟上检测该蛋白对TMV的抑制率,发现有较好的抗TMV活性,其抑制TMV的中浓度C_(50)为0.240μg/mL。同时以HepG2.2.2.15细胞株为模型,对所获得的蛋白进行体外抗乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)效果的评价。结果表明该蛋白对HBsAg的50%抑制时的浓度为0.08μg/mL,但对HBeAg效果不大。 通过DEAE-SepharoseFF离子交换层析、Superdex75凝胶层析和高效液相色谱,从金针菇(Flammulina velutipes)中可获得抗烟草花叶病毒蛋白Zb,该蛋白在不同季节的金针菇上其含量是不同的。采用半叶法在心叶烟上检测抗烟草花叶病毒活性,发现该蛋白的抑制中浓度为4.4μg/mL。通过负染和胶体金染色电镜观察,发现Zb蛋白可导致TMV粒体的崩解,推测是对外壳蛋白在起作用,而非对核酸起作用。同时检测该蛋白体外抗HBV的活性时,发现也是对HBsAg作用明显,50%抑制时的浓度为0.117μg/mL,而对HBeAg无明显作用。 检测Zb蛋白的活性时还表明它有较好的凝集素活性。当Zb蛋白的初始浓度为0.2961mg/mL时,对兔血红细胞以及人的O、A、B三种类型的血红细胞的血凝滴度均为2~(-12)。在检测Zb蛋白的抑制肿瘤的试验中,对胃癌细胞株MGC80-3的抑制率在50%时的Zb蛋白浓度约为0.75μg/mL,且发现Zb蛋白主要是导致MGC80-3细胞的裂解。以载玻片上孢子萌发法检测了Zb蛋白的抑制植物病原真菌和细菌的作用,没发现对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、辣椒盘长孢(Colletotrichum piperatum)三种真菌及青枯假单胞菌(Pseudomonas solanaceavum)、黄单胞杆菌(Xanthomonas oryzae(Vyedaet Ishiyama)Dowson)二种细菌有抑制作用。 对Zb蛋白的生化特性进行了研究,研究表明该蛋白是分子量为30kDa的单 祸建农林大学博士学位论文y 亚基蛋白,没有结合糖,其等电点为4.7。测定了它的N-端20个氨基酸序列为: PQVKTSWEDLANLGWPIQQV。由此可确定Zb蛋白是已报道的TDP蛋白和flamfnutoxin 蛋白。通过质谱分析,获得了该蛋白的肽质量指纹图谱。通过SDS干AGE的进一 步纯化,切取Zb蛋白条带,皮下多点注射家兔,可获得效价较高,特异性强的 Zb蛋白抗血清。 采用盯-PCR从金针菇中获得了Zb的CDNA序列,根据它的开放阅读框可知 该蛋白是由272个氨基酸残基组成,其中只有一个半耽氨酸残基,不含分于间和 分子内h硫键。以Zb基因上的特异性5;物进行PCR扩增,检测了阿魏蘑、鸡腿 菇、猴头菇、金针菇、小平菇、雪杨、香菇、鲍鱼菇、紫抱平菇、草菇和榆黄蘑 这 11种食用菌所提总 DNA的扩增情况,结果和金针菇一样,除草菇以外都可出现 860hP左右的特异性条带。但以另一对引物进行PCR扩增,在草菇、滑菇和灵芝 中又可扩增到与金针菇中大小相同的830hP的片断。以地高辛标记的探针进行 Southern blot检测,对金针菇、草菇、滑菇、鲍鱼菇、香菇、灵芝、雪杨、猴 头和阿魏蘑的PCR产物可起阳性反应。采用间接ELISA的方法,以Zb蛋白的抗 血清,检测了茶树菇、高温平菇、鲍鱼菇、雪杨和香菇这5种食用菌菌盖和菌柄 中存在Zb的同源性蛋白情况,结果表明其它食用菌中存在与Zb抗血清起反应的 蛋白。最终经DNA测序表明在猴头菇(一个位点的差异)和鸡腿菇中存在基本相 同的序列。 将Zb基因导人烟草中,检测表明Zb基因己经转入烟草植株中。日前发现有 一株转基因烟有异常现象,其它均生长正常。经供毒试验表明,发现一株生长 矮小的植株有一定抗性。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:Q946

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