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《福建农林大学》 2002年
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农杆菌介导荔枝(Litchi chinensis Sonn.)遗传转化体系的建立及导入LEAFY基因研究

曾黎辉  
【摘要】: 本研究通过切片观察荔枝胚性愈伤组织分裂生长的方式,为遗传转化受体材料的选择提供依据;系统研究了根癌农杆菌介导荔枝遗传转化的影响因素和转化细胞的筛选和再生,建立荔枝遗传转化体系,为荔枝新品种的培育开辟新途径;构建拟南芥LEAFY基因的植物表达载体,将LFY基因导入荔枝“元红”品种,获得再生植株,为研究花分生组织特性基因在荔枝实生苗体内的过量表达对荔枝童期及其开花特性的影响奠定基础。 1.通过石蜡切片观察荔枝胚性愈伤组织的结构以及分裂、生长的方式,并与龙眼胚性愈伤组织作比较。荔枝胚性愈伤组织颗粒由胚性细胞和非胚性细胞组成,胚性细胞分布在愈伤组织团的外围,内部为非胚性细胞;荔枝胚性愈伤组织的分裂生长以外起源为主,新愈伤组织团的形成起源于表层单细胞,因此,荔枝胚性愈伤组织是农杆菌介导转化的合适受体。龙眼胚性愈伤组织颗粒也由胚性细胞和非胚性细胞组成,与荔枝不同的是,胚性细胞是散布在愈伤组织团中,胚性愈伤组织的分裂生长以内起源为主,分裂中心也处于细胞团的内部。 2.使用带有内含子的GUS基因(uidA)的瞬时表达来研究农杆菌介导转化最初步骤中影响基因转移的因素。结果表明在AGL-1、LBA4404以及EHA105三种菌株中,EHA105对荔枝的侵染力最强;采用两天的共培养时间既有较高的瞬时表达率,又避免了农杆菌的过度生长;0.5×10~8个细胞/ml的菌液密度为最佳侵染浓度;继代培养15天的胚性愈伤组织处于最旺盛分裂的时期,易于接受外源DNA;在转化前将转化材料进行1h的干燥预处理有利于转化率的提高。 福建农林大学博士论文 摘要 3.建立农杆菌介导荔枝遗传转化体系。以荔枝胚性愈伤 组织作为转化受体,超致病力菌株EHA105侵染,G418作为转 化细胞的选择剂,抗性愈伤组织通过体胚发生再生植株。采用 抗性愈伤组织、体胚发生、体胚萌发三个步骤的严格筛选避免 嵌合体的产生。 4.利用中间表达载体 PB构建 LFy基因带有植物组成 型启动子一CaMV35S的植物表达载体pBILFY。通过三亲交配法 将pBILFY导入农杆菌菌株EHA105。 5.将L尸厂基因导入荔枝“元红”品种,获得转基因植株。 经PCR—Southern杂交检测,证明外源基因己整合到三株转基 因植株基因组中。
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