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《福建农林大学》 2002年 博士论文
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人表皮生长因子基因的克隆、表达及其在植物中的遗传转化研究

陈廷速  
【摘要】: 香蕉是我国南方一些省重要的水果,但目前香蕉产业存在许多问题,如香蕉品质差、病虫害严重等。基因工程方法可将有用的外源基因导入香蕉,从而促进香蕉优良品种的培育,提高香蕉的品质,增强市场的竞争力。同时,香蕉作为生物反应器具有它的优越性,用它来表达一些医药蛋白具有广阔的前景。 本研究采用PCR方法克隆了人表皮生长因子基因,构建了原核表达载体和植物表达载体,研究了原核表达的外源蛋白的生物学活性;用薄层培养方法优化了香蕉、芦荟的受体再生系统;首次通过农杆菌介导法将人表皮生长因子基因导入香蕉获得抗性芽;系统研究了影响根癌农杆菌介导的香蕉、芦荟遗传转化的因素。 研究工作获得如下的几个方面的结果: 1、用PCR方法克隆了人表皮生长因子基因。 2、构建人表皮生长因子基因的原核表达载体和植物表达载体。植物表达载体p1301hEGF以35S为真核表达启动子,报告基因和目的基因以Tnos为终止子,植物选择标记基因以35S PolyA加尾,构成嵌合基因。原核抗性为Kan~r。 3、用原核表达得到的融合蛋白(GST-hEGF)进行了小鼠试验,证实其具有很高的免疫原性;用纯化得到的hEGF进行细胞活性检测,表明其能促进细胞生长。 4、建立了以香蕉吸芽为材料,诱导低代香蕉丛生芽,并用此材料进行薄层切片培养,同时对薄层切片的芽分化条件进行了系统的研究。通过这种方法能得到较高的芽分化率。 5、尝试用基因枪(PDS-1000Hi)对薄层切片进行转化,但没有筛选到转化体。 6、初步建立了一个有效的以农杆菌介导的香蕉转化系统。对3个菌株(EHA105、LBA4404和AGL1)浸染力比较研究表明,采用菌株EHA105介导的转化效率高;优化了各种影响转化的因素,如乙酰丁香酮(AS)、蔗糖、重悬液pH值、共培养条件、菌株、共培养时间、工程菌液的制备等。 7、在国内外首次获得仅以农杆菌介导的香蕉转基因抗性芽,也是首次将人表皮生长因子转化到植物中。经过筛选获得抗性芽,并对其进行dot-blotting杂交检测及PCR-Southern分析,证明外源基因已经整合到香蕉基因组中。 8、以芦荟试管苗为材料,采用薄层切片培养方法诱导芽的分化,并对影响薄层切片芽分化的多种因子进行了研究,建立了芦荟遗传转化受体系统。这些研究目前国内外未见报道。 9、对影响农杆菌介导的芦荟遗传转化的一系列因素进行了研究,初步建立了以农杆菌介导的芦荟遗传转化体系。首次将人表皮生长因子转入芦荟,获得较高的GUS基因瞬时表达率。


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