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《福建农林大学》 2002年
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花生等三种植物的RAPD分析与花生再生和转化体系优化的初步研究

陈由强  
【摘要】: 本研究包括四个部分:一、花生DNA提取、PCR反应条件优化及其栽培品种RAPD的分析;二、长叶榧(Torreya jackii Chun)的RAPD分析;三、应用RAPD技术对杉木地理种源遗传变异的分析;四、花生体细胞胚和丛生芽的诱导、再生及转化体系优化的初步研究。 在花生新鲜幼叶和干叶DNA提取过程中,应用pH值较低无机盐浓度较高的提取缓冲液沉淀蛋白质,其中加入2%的β-巯基乙醇可有效地防止因次生代谢物质引起的DNA变色。提取出的DNA样品产率约92.6~216.3ng/mg.fw之间,DNA质量和纯度较高,260nm/280nm光密度比值在1.8-1.9之间。所得DNA可直接用于限制性内切酶酶切,并可用于随机引物PCR扩增。花生RAPD理想的反应体系如下,每10ul反应体积中含:50mmol/LKCl,10mmol/LTris-HCl(pH9.0),0.1%Triton-100,20~40ng引物,0.2 nmol/ul的dNTPs,1~2ug/ul的BSA,1.5nmol/ulMgCl_2,0.5~1单位Taq酶(以上均为Sangon Ltd.产品),30~60ng左右花生基因组DNA。 应用随机扩增多态性DNA技术对12个花生品种遗传多样性进行分析。从80个随机引物中筛选出20个进行扩增,共扩增出180条带,其中132条具有多态性,占73.33%。平均每个引物提供9个RAPD标记的信息量。计算了12个花生品种的遗传相似系数和遗传距离。应用Unweighted pair-group average方法进行聚类分析。聚类结果金花39-2-19和金花39-2-51距离最近,并与它们父本泉花10号聚为一类。金花101,金花103和它们的父本汕油71聚为一类。白皮1号与粤油202聚为一类。而鲁花14,中花2号,梧油6号,以及TW04各为一类。表明在DNA水平上可以分析花生品种之间的亲源关系。 以长叶榧幼叶为材料,研究结果表明最佳的RAPD反应体系为:15ul反应体系中含50mmol/LKCl、10mmol/LTris-HCl(pH9.0)、0.1%Triton-100、2nmol/ul MgCl_2、0.6nmol/ul dNTPs、0.75 U Taq酶、30ng引物以及100ng左右的长叶榧基因组DNA。 利用18个引物对来自3个不同居群的66个长叶榧样本进行分析。结果表明长叶榧种群水平的多态位点百分率达:86.93%,居群水平的多态位点百分率为:83%、68%和80%。种群水平的Nei氏基因多样性指数为:0.2479,居群水平的Nei氏基因多样性指数分别为:将石自然保护区长叶榧居群0.2182、许坊埂长叶榧居群0.1684、许坊水库长叶榧居群0.1881。Shannon信息指数的分析结果与之相符,说明了长叶榧仍保留有较高的遗传多样性。长叶榧居群间的变异量占总的30.35%,居群内的变异占总的69.63%,居群间的变异量较小与基因分化系数Gst和种群间的分化度Fst的分析结果是一至的,这说明了该物种的生存空间较小,适应范围不广。长叶榧的基因流为1.6899,显示长叶榧仍具有通过群体间的基因交流来防止遗传漂变造成的群 体分化的能力。 应用随机扩增多态性 DNA技术对我国 12个有代表性的杉木地理种源 遗传多样性进行分析。从80个随机引物中筛选出20个进行扩增,共扩增出 ,149个 DNA片段,其中具多态性的片段有 115个,占 77.18%。表明杉木地 理种源间具有丰富的DNA序列多态性。平均每个引物提供7.45个RAPD 标记的信息量。扩增出的 DNA片段大小一般为 150到 2000hP范围之间。 12个杉木地理种源间遗传距离在0二932wt667范围之间变动。聚类结果表 明,在0.乃44处,广东信宜,广西梧州,湖南会同,湖南江华,贵州锦屏, 江西全南聚为一类。福建沙县,浙江开化,湖北咸宁,安徽休宁聚为一类。 四川雅安,陕西南郑各为一类。 以花生成熟胚培养成的无菌苗叶节为外植体,在高浓度 6-BA(30mg/L)M培养基中,光强2000Lux,25土3℃和14/10光暗比条件下 培养,50天后全部诱导分化出整齐一致的丛生芽,每个外植体平均产生8二5 个丛生芽;切下带少许丛生芽的组织块转入含6-BA(30m叭),LH(400m叭) 和YE(0刀1%)的MS培养基中,可诱导出新的丛生芽,诱导率达98.70%; 平均出芽 13.86个。将花生成熟胚轴转接于含NAA(lin。L)和 6-BA(3m叭) MS培养基中,20-30无后,诱导出大量正常的体细胞胚,诱导率达95厂%, 将胚切成小块转入含2,4-D(20m旮L),6-BA(3m乡L)和 LH(200mg/Lg/L)MS培 养基中,经15无培养,诱导出白色致密的胚性愈伤组织。 S 以4 d龄的泉花10号花生小叶作为外植体,从25种培养基中筛选出 MS+AgNO。l刀m叭+6—BA 5刀m叭+NAA 2.sing/L培养基为仗芽点培 .养基,MS+AgNO31刀mg/L+6—BA 5刀mg/L十NAA刀mg/L培养基为长愈 伤组织培养基;以4d龄小叶、子叶、胚轴、及子叶与胚轴相连处为外植体 在 MS+A酬O。l.om乡L+6—BA 5.om叭+NAAZ.sing/L培养基上培养,结 果表明小叶是诱导长芽
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