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《福建农林大学》 2002年
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福建马铃薯病毒的分子鉴定与检测技术

吴兴泉  
【摘要】: 依据马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)外壳蛋白(CP)基因序列(885bp)设计合成了一对引物,以带毒植物总RNA为模板,通过反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增得到长0.88kb的目的片段。将目的片段转入大肠杆菌(E.coli)并进行测序。序列测定结果与其他PVS分离物CP基因序列比较,发现核苷酸同源性可达95%左右,氨基酸序列同源性可达98%左右,证明成功地得到了PVS CP基因。依据PVS CP氨基酸序列对其不同分离物间分子差异进行分析。结果表明,PVS不同分离物间CP氨基酸序列存在明显差异,同源性在90%-100%之间。依据PVS CP氨基酸序列同源性建立了PVS系统进化树并对PVS不同分离物进行了类型分析。 构建了含PVS CP基因的融合蛋白原核表达载体,并在大肠杆菌(E.coli.)中得到表达,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定融合蛋白的分子量为58kDa。Western blot印迹结果显示,GST-SCP与PVS抗血清有很强的免疫反应,表明GST-SCP具有天然状态下病毒核衣壳蛋白的抗原性。制备了GST-SCP抗血清,并应用此抗血清建立了PVS间接ELISA检测技术,检测灵敏度为1mg鲜重的病株叶片。 报道了四种PVS的分子检测技术:一步-RT-PCR检测技术(One-step RT-PCR)、免疫捕捉-RT-PCR(imminocapture-RT-PCR,IC-RT-PCR)检测技术、核酸斑点杂交检测技术(Nucleic acid spot hybridization,NASH)和PCR-微量板杂交检测技术。一步RT-PCR检测技术较常规RT-PCR方法更加快速简捷,IC-RT-PCR可在不需提纯病毒RNA的情况下实现对病毒的检测,两者的灵敏度与常规RT-PCR检测方法相同。建立了PVS NASH检测技术并对其进行了较大的改进,证明此方法简便快捷,更适合于大量样品的检测。PCR-微量板杂交检测技术避免了PCR检测方法中电泳检测时溴化已锭(EB)可能造成的污染。 依据马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)CP基因序列(711bp)设计合成了一对引物X1、X2,以带毒植物总RNA为模板,通过RT-PCR扩增得到长0.7kb的目的片段,将目的片段转入大肠杆菌并进行测序。测序结果与其他PVX分离物CP基因序列比较,发现其核苷酸同源性最高可达95%,CP氨基酸序列同源性最高达97%,证明为PVX CP基因。依据PVX CP氨 t。’ 福建农林人学博十论文X 基酸序列对已知 26个 PVX不同分离物进行差异性分析,结果表y] PVX不 同分离物间*P氨基酸序列存在差异明显,同源性在86%99%之M。依据P*X CP氨基酸序列建立PVX系统进化树并对PVX进行了类型分析。 构建了含 PVX CP基因的融合蛋白原核表达载体,并在 E COlt.中得到表 达,SDS-PAGE测定融合蛋白的分于量为 52kDa。Western blot印迹结果显示, GST-XCP与PVX抗血清有很强的免疫反应,表明GST-XCP具有天然状态 下病毒核衣壳蛋白的抗原性。制备了GST-XCP抗血清,并将间接ELISA方 法应用于 PVX的检测,检测灵敏度为 ling鲜重的病株叶片。 利用病毒特异性引物XI、XZ建立了PVX的常规RT-PCR、一步RT-PCR 和 IC.RT-PCR检测技术,证明 RT-PCR检测技术灵敏快速,特异性强。以地 高辛(igoxigenin,DIG)标记的 PVX CP基因为探针建立了 PVX核酸斑点 杂交检测技术和PCR-微量板杂交检测技术,并进行了改进,实践证明此方 法快速灵敏,更适合于大量样品的检测并可避免核酸电泳时EB的污染。 依据P*YPI基因序列设计合成了一对引物*P】,*PZ,以带毒样品植 物总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增得到了0.83kb的目的条带,克隆 并测序结果表明为PVY PI基因。通过对PVY PI蛋白氨基酸序列分析发现 PVY不同分离物间*蛋白氨基酸序列存在明显差异,氨基酸序列同源性在 64%-94%间。依据门蛋白氨基酸序列建立的PVY系统进化树并对PVY进 行了类型分析。构建了含 PVY PI基因的融合蛋白原核表达载体,并在 E COlt. 中得到表达,SDS-PAGE测定融合蛋白 GST-YP的分子量为 57kDa; 利用引物YP和YPZ,对于带毒样品RNA可通过RT-PCR可扩增得到 0.83kb的目的条带,而健康对照无此目的片段,从而建立了PVY的常规 RT-PCR检测技术。以此为基础,在一个反应中同时加入反转j天和 PCR反应 所需试剂,反应程序中包含反转录和P*R的所需条件,建立了P*Y一步 RT-P*R检测技术。利用吸附于固相酶联板上的PVY特异性抗血消对病奇进 行捕捉纯化及热处理后,直接进行RT-盯R成功地扩增得到0.83讪的口的片 段,而对照无扩增片段,从而建立了P*YI*-RT-P*R检测技术。上述两种 方法与常规方法灵敏度相同,但更为简捷、快速、易于操作:利用地高辛标 记的 PV
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:S432.41

【引证文献】
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【参考文献】
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 台莲梅;马铃薯早疫病菌多样性和侵染过程及品种抗病机制研究[D];黑龙江八一农垦大学;2011年
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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【同被引文献】
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中国博士学位论文全文数据库 前5条
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【二级引证文献】
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2 邸宏;田兴亚;卢翠华;吕文河;石瑛;秦昕;王凤义;陈伊里;;马铃薯抗PLRV研究进展[A];中国作物学会马铃薯专业委员会2000年年会论文集[C];2000年
3 王文重;李学湛;白艳菊;于德才;范国权;马纪;;国内外有关马铃薯蚜虫防治技术[A];2006年中国作物学会马铃薯专业委员会年会暨学术研讨会论文集[C];2006年
4 李学湛;白艳菊;吕典秋;何云霞;张儒喜;朱财;王毅;谢开云;;应用DAS-ELISA法同时检测多种马铃薯病毒[A];中国作物学会马铃薯专业委员会2000年年会论文集[C];2000年
5 梁金平;;福建马铃薯脱毒技术的研究与应用[A];中国作物学会马铃薯专业委员会2008年马铃薯大会论文集[C];2008年
6 程天庆;;关于提高我国马铃薯种薯质量问题的探讨[A];中国马铃薯学术研讨文集(1996)[C];1996年
7 王黎黎;杨水英;孙现超;李莉;吴畏;任芳;青玲;;重庆马铃薯病毒病病原血清学鉴定[A];植物保护科技创新与发展——中国植物保护学会2008年学术年会论文集[C];2008年
8 柳俊;谢从华;;马铃薯退化及其防治技术进展[A];中国作物学会马铃薯专业委员会2000年年会论文集[C];2000年
9 张雅奎;吴凌娟;温福君;;大兴安岭地区马铃薯种薯生产体系研究[A];中国作物学会马铃薯专业委员会2001年年会论文集[C];2001年
10 王季春;吕长文;唐道彬;何凤发;盖琼辉;;马铃薯不同热处理方式脱毒效果比较研究[A];中国作物学会马铃薯专业委员会2008年马铃薯大会论文集[C];2008年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 彭溢;我省马铃薯病毒检测技术走出国门[N];黑龙江日报;2010年
2 记者 李小伟;我省马铃薯病毒检测技术走出国门被推广应用[N];黑龙江经济报;2010年
3 郭艳梅;马铃薯病毒病及其防治[N];山西科技报;2003年
4 刘欣;黑龙江马铃薯病毒病研究取得新突破[N];农民日报;2004年
5 江西农业大学农学院 陈须文 提供;马铃薯病毒病[N];河南科技报;2006年
6 晓伟;什么是马铃薯病毒退化[N];农民日报;2006年
7 郭伟;马铃薯病毒退化对生产有哪些危害[N];农民日报;2006年
8 罗春华;“土豆豆”变“金蛋蛋”[N];人民日报;2007年
9 戴铁生;马铃薯不宜连年留种[N];辽源日报;2005年
10 记者:胡唯元;“标准化”破解马铃薯产业“三道考题”[N];科技日报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 吴兴泉;福建马铃薯病毒的分子鉴定与检测技术[D];福建农林大学;2002年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 时妍;马铃薯病毒快速检测技术的建立与应用[D];河南工业大学;2012年
2 谢长炜;福建马铃薯病毒病的快速检测技术[D];福建农林大学;2013年
3 董代幸;乌鲁木齐地区马铃薯病毒和类病毒的分子鉴定及检测技术研究[D];新疆农业大学;2010年
4 姚贵敏;内蒙古中西部三种马铃薯病毒及病程相关蛋白的初步研究[D];内蒙古农业大学;2010年
5 袁青;马铃薯病毒多重RT-PCR检测技术研究[D];西南农业大学;2004年
6 代廷非;多重RT-PCR技术检测马铃薯病毒的研究[D];四川农业大学;2011年
7 吴婕;加拿大进境马铃薯有害生物风险分析及RT-PCR病毒检测技术研究[D];四川农业大学;2010年
8 陈炜;三种马铃薯病毒脱毒技术优化研究[D];内蒙古农业大学;2010年
9 刘星;法国、荷兰、俄罗斯三国进境马铃薯有害生物风险分析及RT-PCR病毒检测技术研究[D];四川农业大学;2009年
10 谷宇;马铃薯病毒与类病毒检测芯片的制备及应用[D];东南大学;2004年
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