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《福建农林大学》 2002年
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人乳铁蛋白基因在胡萝卜(Daucus carota L.)中的表达及其功能研究

郑回勇  
【摘要】: 乳铁蛋白是一种糖蛋白,为转铁蛋白家族的一员,在人和哺乳动物的许多器官与组织中广泛分布。乳铁蛋白具有多种生物学功能,这些功能包括:促进人体肠道对铁的吸收及调节体内铁的平衡;广谱抗菌(细菌和真菌)、抗病毒感染作用等。把人乳铁蛋白基因转入富含类胡萝卜素和植物纤维的胡萝卜,让它合成具有生物活性的人乳铁蛋白,相当于在营养丰富的胡萝卜中添加新的营养保健因子。乳铁蛋白强的铁螯合能力和广谱抗菌、抗病功能,可提高转基因胡萝卜铁的含量,增强胡萝卜抗菌、抗病能力。 本研究在对胡萝卜组织培养及遗传转化体系进行优化的基础上,构建了人乳铁蛋白基因植物表达载体,在农杆菌介导下,首次把人乳铁蛋白基因导入胡萝卜,获得了转基因植株。对转基因植株进行分子检测,证实了外源基因已整合到胡萝卜基因组中。功能研究和成分测定表明,转基因胡萝卜具有抗菌活性,其铁含量也得到提高。具体结果如下: 1.建立了高效的胡萝卜组织培养及再生体系 以适于生产饮料的胡萝卜“新黑田五寸人参”为材料,研究不同外植体、不同培养基,不同培养条件对胡萝卜愈伤诱导及再生的影响,建立一套高效的胡萝卜组织培养再生体系:最适于诱导愈伤的外植体是弱光或黑暗下发芽7-10d无菌苗下胚轴,最适合的愈伤诱导培养基和继代培养是B_5C(B_5+0.5mg/L 6BA+0.5mg/L2,4-D),最适于植株再生的培养基为不添加任何激素的B_5或MS,组织培养条件为25℃、光照周期为16hr/8hr。适当照射日光对植株再生具有很好的促进作用。 2.建立了高效的遗传转化体系 以pBI121和pTOK233为转化质粒,在农杆菌LBA4404介导下,对胡萝卜遗传转化体系进行系统研究,首次为该胡萝卜品种建立 一套高效的遗传转化体系,结果为:最适转化受体为新鲜下胚轴 及经预培养的下胚轴;共培养时,低浓度的乙酞丁香酮(25 pM) 对转化具有促进作用;适宜的卡那霉素筛选浓度是loom岁L。筛选 时,卡那霉素浓度先低后高,植株再生时完全去除,有利于缩短 植株再生周期。 3.人乳铁蛋白基因在胡萝卜中的转化及分子检测 以pBll21为中间载体,把人乳铁蛋白基因替换到GUS位置上, 构建成表达载体pBIhLF。在农杆菌LBA4404介导下,把目的基因 导入胡萝卜,获得了外表正常的抗性植株。PCR检测、Southem杂 交证实了外源基因已整合到抗性植株基因组DNA中。对转基因植 株进行RT一PCR检验,得到了阳性结果,说明外源基因在胡萝卜中 能正常转录。 4.转基因植株抗菌能力加强,铁含量得到提高 提取转基因植株叶片粗蛋白,以大肠杆菌DHSQ和酵母菌 AHIOg为试验靶标,侧定了转基因植株粗蛋白的抑菌活性。结果表 明,转基因植株叶片粗蛋白对DH5a有强烈的抑制作用(当培养基 中粗蛋白为lmg/ml时,每ml菌数为对照的1.47%),对AH109的抑 制作用较弱。按GB汀13883一92标准测定了部分转基因植株叶片中 铁含量。在测定的植株中,铁的含量都得到提高,其中一株提高 64%。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:Q786

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【参考文献】
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