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《福建农林大学》 2003年
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稻瘟病菌T-DNA插入突变研究

李宏宇  
【摘要】: 稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)既是经济重要的病原真菌,也是研究植物与微生物相互作用的重要生物,从全基因组水平分析研究该菌关键基因的功能,可以加速对稻瘟病菌生物学及其致病分子机制的认识,为培育持久抗病品种和制定稻瘟病菌持续管理的策略提供理论依据。为此,本研究利用农杆菌介导转化T—DNA插入技术,大规模创建稻瘟病菌T-DNA插入突变体,并对部分突变体进行了分析,取得了如下结果: 在Mullins等建立的农杆菌转化Fusarium方法基础上,进一步优化了农杆菌介导转化稻瘟病菌获得T-DNA插入突变的条件,包括选择转化子的潮霉素B用量、抑制农杆菌的抗生素头孢噻肟钠和羧苄青霉素的配比、不同转化阶段培养基的选择等。 多次转化结果表明农杆菌转化稻瘟病菌分生孢子的效率为每转化1*10~6孢子可以得到约385个插入转化子。分子检测表明所有转化子均含hph基因插入,但是只有约85%含T-DNA插入。Southern杂交结果表明突变体中含1—3个拷贝的T—DNA插入,其中50%为单插入。 随机取120个突变体进行形态发育观察,发现了13个颜色突变体、5个生长速度减慢突变体、14个孢子形态和产孢突变体、2个孢子萌发和10个附着胞形态和形成突变体。 在C101LACPi-1(t)、C101A51Pi-2(t)、C104PKTPi-3(t)、C101PKTPi-4a、C105TTP-4L-23Pi-4b、BL22(Pi-9)、多系1号、CO39和LTH等9个品种上,对160个突变体进行毒性分析,结果发现15个致病性减弱突变体,40个致病性增强突变体。在致病性增强突变体中,有17个突变体致病性由无毒变为有毒。 TAIL-PCR可以有效地扩增T-DNA插入侧翼稻瘟病菌基因组序列,AD9是最佳随机引物。对10个TAIL-PCR特异产物测序分析,结果表明6个T-DNA插入在基因上,4个则插入在基因间隔区中,并将10个侧翼序列登陆在GeneBank上,登陆号为AY295779-AY295788。 推测蛋白MG03076.1、MG09558.1、MG08181.1被标签后,其对应的突变体T940001901、T940003102和T940002001分别表现为对Pi-1(t)致病性增强;对CO39的致病性显著减弱;对Pi-1(t)和Pi-4a的致病性增强,可能表明这些基因与稻瘟病菌致病性有关。 福建农林大学博士学位论文 突变体T940000302对尸i一I(t)和pi-甲b致病性增强,T94000一001对尸1-1(t) 从无毒变为有毒,T940001 604对Pi-I(t)和Pi一夕的致病性增强,但是分析其 T-DNA插入却发现是分ZIJ插在MG02674.1与MG02675.1、MG09558.1与 MG09559.l、MG08092.1与MG08093.l之间隔区中,说明T-DNA插在与致 病性有关的基因调控区。 在突变体T940004402中,T-DNA插在稻瘟病菌推导蛋白NCU03 146.1 上,该蛋白在Saccharo袱lyces cerevisia。和Schizosaccharomycespombe中也有 同源蛋白,但未观察到任何表型发生变化。 本文利用农杆菌转化方法成功地将T-DNA插入稻瘟病菌基因组,获得了 一批基因被标签的突变体,并发现了若干关键性状对应的基因,是稻瘟病菌 功能基因组学的良好开端,具有重要的科学意义和应用前景。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S435.111

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