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《福建农林大学》 2003年
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花椰菜单染色体RFLP体系的构建

李金泉  
【摘要】: 花椰菜是一种经济价值很高的蔬菜作物,原产地中海沿岸,十九世纪中叶传入我国,现已有很多地方品种和改良种,遗传资源丰富,而花椰菜的分子连锁图谱及相关分子生物学研究则相当贫乏,只有极少的文献做出相关报道。 本研究对花椰菜单染色体RFLP体系构建的一些相关方面进行了探索。(1)以4个花椰菜F_1的12个花药培养植株为材料,进行了花椰菜花药培养植株遗传多态性的研究,找到遗传多态性较高的5对亲本,为花椰菜分子连锁图谱群体的构建奠定了基础;(2)以福建地方品种“闽花60天”为材料,进行染色体的显微分离、体外扩增研究,为花椰菜单染色体RFLP体系构建做技术准备;(3)以分离到的花椰菜单染色体扩增产物为模板,进行花椰菜单染色体R基因同源克隆研究,为花椰菜单染色体RFLP的探针来源开辟了一条新途径,并得到5个抗性基因类似物(RGA),可以用作进一步的分子生物学研究。主要结果和结论如下: 1 RAPD技术分析花培植株的多态性 1) 以12个花培植株中两份材料(编号为AC07、AC10)基因组DNA为模板对53个RAPD引物进行了筛选,共有32个引物扩增出清晰可见的条带,其中有19个引物的扩增产物表现出多态性,多态性引物的比例为59.4%。 2) 以全部12个花药培养植株(编号为AC01-AC12)的基因组DNA为材料,用筛选出的19个引物对其进行扩增,选出扩增条带清晰的10个引物扩增结果(138条带),运用Dice法进行遗传相似系数的计算和分析,我们得到遗传多态性较高的5对亲本,依次为AC09与AC12,AC08与AC12,AC07与AC12,AC04与AC09,AC04与AC07。 3) 将10个引物所扩增的138条条带进行聚类分析,分析表明,该12个花椰菜花培植株可以划分为三组,第一组包括AC01,AC02,AC03,AC04,AC10,AC11,AC12;第二组包括AC05,AC06,AC07,AC08;第三组只有AC09。其中第一组又可分为两个亚组:AC01,AC02,AC03,AC04为一亚组;AC10,AC11,AC12为另一亚组。聚类分析结果与田间杂交配组和所取的单株花药培养情况完全一致。 2 花椰菜单染色体的显微分离和体外扩增 1) 以“闽花60天”种子根尖为材料,经酶解低渗法制片,用微细玻璃针法总共分离到40多条花椰菜单染色体。 2) 以分离的花椰菜单染色体为材料,用两种扩增方法(LA-PCR和DOP-PCR)成功地对花椰菜单染色体进行了体外扩增。其中,采用LA-PCR方法获得的扩增片段 花椰菜单染色体RFLP体系的构建2 较大,且污染控制相对容易。 3)分别以基因组DNA和任一条单染色体的扩增产物为探针,应用 southem一blotting杂交,证明了扩增产物确实来源于基因组。 3单染色体NBS一LRR类R基因同源序列的克隆和分析 l)选用两对根据R基因保守结构域设计的简并特异引物(X3亿:和Y:扩LP.:),对 花椰菜基因组DNA进行了扩增,其中X3/z:能扩出soobP左右的日标条带。对其克隆、 酶切归类,共得到12类RGA。选取一个克隆hsol进行测序,同源检索表明为RGA, 说明X3亿:引物组合对扩增花椰菜RGA是有效的。 2)选用引物组合X3/Z:对花椰菜的一条染色体扩增产物进行了RGA扩增、克隆、 酶切归类,发现从该染色体克隆到的RGA可以分成7类,对7个克隆 (hs02,hso3,hso4,hs05,hs06,hso7,hsos)测序后,得到5个克隆测序结果(hsoZ,hso3,hsos, hs06,hS08)。 3)对克隆到的6个序列进行Blast分析发现,从基因组DNA中克隆到的hsol 为RGA,从单染色体扩增产物中克隆到的hs05不是RGA,其余4个(hs02,hs03, hs06,heOS)均为RGA,它们与已克隆的油菜、甘蓝、拟南芥的RGA具有很高的同 源性。 4)以上述5个RGA序列与6个已知的R基因序列应用MegAlign软件进行比较 分析发现,本研究获得的5个序列与己知植物R基因相应序列的一致性分布范围为 11.4%一64%,其中序列hs08与尺尸害J和尺尸乙I的同源性最高,一致性分别高达64%、 61.1%。聚类分析表明,它们分为两大类:heOI,hs02和hs03与已知基因N,五乙天尸尸1, L石聚为一类;hs06和hs08与已知基因尺尸乙了和天尸sj为一类。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S635

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