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《福建农林大学》 2004年
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苏云金芽孢杆菌vip3A基因及杀虫防病工程菌研究

吴燕榕  
【摘要】:营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal proteins,VIPs)是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thruingiensis,Bt)在对数生长中期分泌的一类新型杀虫毒蛋白,它对鳞翅目昆虫具有较广谱的杀虫活性。Vip3A蛋白通过诱发细胞凋亡,最终导致昆虫死亡,这种作用机理与Bt杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins,ICPs)的作用机理完全不同。本文对实验室保存的菌株进行vip3A基因的检测,克隆了vip3A—WB5基因并在大肠杆菌中得到高效表达。应用生物信息学对vip3A—WB5基因的序列进行了分析。将vip3A—WB5基因导入具有防病、内生和促生功能的野生枯草芽孢杆菌中,构建了多功能工程菌。 用PCR方法对本室保存的菌株筛选获得30株含有vip3A基因。从中挑选对夜蛾科(Noctuidae)害虫具有较高毒力的WB5菌株,进行vip3A基因的克隆和测序。克隆得到的vip3A-WB5基因序列翻译为Vip3A-WB5蛋白一级序列,基因编码789个氨基酸残基。将Vip3A-WB5蛋白的氨基酸序列利用在线的Blast软件进行同源性分析。结果表明,该蛋白与已报道的8个Vip3A蛋白同源性达90%以上,与其它蛋白无同源性。应用NCBI的在线软件(NCBI Conserved Domain Search)分析表明,Vip3A-WB5蛋白具有CBM—4—9功能区,这是一个糖结合位点,这个结合位点与其作用机理密切相关。通过TMHMM2.0(http://genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)分析表明,Vip3A-WB5蛋白具有信号肽,是一种跨膜蛋白。在线软件PredictProtein分析表明,Vip3A-WB5蛋白的二级结构中28.96%为螺旋结构,25.69%为折叠结构,45.35%为成环结构,经预测整个蛋白的三维结构呈紧密的球状。 将克隆的vip3A—WB5基因插入表达载体pET29a(+),构建重组表达质粒pETvip-WB5,将其转化到大肠杆菌BL21,经1mmol/L IPTG诱导表达89kDa大小的Vip3A蛋白。将Vip3A蛋白对斜纹夜蛾的2龄幼虫进行生物测定,结果表明具有较高的杀虫活性。蛋白可溶性试验表明,目的蛋白大部分可溶,透射电镜观察无包含体存在,其原因有待进一步研究。在自然条件下进行了目的蛋白的纯化,并将纯化的蛋白对家兔进行免疫而制备多克隆抗体。 福建农林大学博士学位论文 将克隆的v加划一WBS基因插入枯草芽抱杆菌的分泌型表达载体 pus186,构建重组分泌型表达质粒pUS186vip一wBS,将其转化到具防病、 内生和促生的野生型枯草芽抱杆菌BSZ中。对工程菌、WBS和BsZ室内抑菌、 内生和促生作用的实验表明:工程菌和BsZ抑菌活性相当,WBS无抑菌作用; 工程菌和BSZ能在白菜体内内生定殖,WBS无内生作用;工程菌、WBS和 BSZ菌液浸种白菜15d后鲜重分别增加155.89%、158.54%和145.27%,对白 菜苗都具有促生作用,苏云金芽抱杆菌WBS对白菜苗具有促生作用这是一个 新发现,有待进一步证实。以上结果表明,将重组分泌型表达质粒pUs 1 86vip 一WBS导入野生型枯草芽抱杆菌BSZ中,并未使其抑菌、内生和促生功能发 生改变。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S476

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