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粉虱座壳孢(Aschersonia aleyrodis)生理特性、致病机理和分子生物学研究

邱君志  
【摘要】:全球每年由烟粉虱对600多种植物造成的经济损失达数十亿美元以上。化学农药曾有效地防治该害虫,但近来研究表明粉虱已对其产生抗药性。作为昆虫病原真菌的重要成员,座壳孢能直接侵入寄主体壁并成功控制粉虱种群。 本研究为更有效地防治烟粉虱,从世界范围收集和国内分离到一批座壳孢菌。通过对烟粉虱毒力测定筛选出高致病性菌株并借助于扫描电镜和光学显微镜研究了粉虱座壳孢对烟粉虱的侵染行为。在室内探讨了碳源、氮源、金属离子、维生素和化学农药对该菌孢子萌发、生长和产孢的影响。还发现了对烟粉虱、桃蚜和白纹伊蚊存在杀虫活性的次生代谢产物。基于RAPD、RFLP和LSU rDNA分子标记对座壳孢菌进行了遗传分析,为本属分子系统学、疑难种鉴定和近缘种的区分提供了技术平台。 主要结果如下: 分离、鉴定 昆虫病原真菌Aa分离自受侵染的柑桔粉虱,对烟粉虱和该科其它成员存在高毒力。利用光学显微镜和电子显微镜技术研究感染昆虫表明其致病性、形态特征和超微结构与以前报道的粉虱座壳孢菌相似。基于形态和毒力研究本菌株定名为粉虱座壳孢Aschersonia aleyrodis Webber。 毒力测试 虫生真菌座壳孢系介壳虫和粉虱的病原菌,能用于烟粉虱的生物防治。对来自世界各地的15株座壳孢菌产孢、萌发和侵染寄主能力进行了比较,发现4株产孢量低(<1×10~7孢子/ml),而另外4株的产孢能力强(>1×10~8孢子/ml)并且11株能感染烟粉虱。侵染水平与孢子萌发率成正相关(r=0.86)。基于产孢和侵染能力,筛选出11株座壳孢对2龄粉虱进行了毒力测试,其侵染水平在17.8%-88%。其中来自中国、日本和爪哇的粉虱座壳孢表现出高产孢量和高致病性。此外,侵染特性表明该菌对1-3龄幼虫敏感而且2龄寄主的侵染率可达88%。 侵染行为 通过生物测定的方法,发现1-3龄幼虫易受真菌侵染,其中以2龄幼虫的侵染率为最高,达到98%;侵染率随处理时间延长、接种浓度增加而增大;被侵染粉虱幼虫死亡通常发生在处理后的下一个龄期。应用扫描电镜和光学显微镜对粉虱座壳孢侵染烟粉虱的过程进行了研究,分生孢子在昆虫体表萌发、形成芽管后可产生附着胞或直接侵入表皮,昆虫节间膜等薄弱处是其侵染的主要部位,随后菌丝在昆虫体内形成,如湿度足够高,菌丝穿出体表产孢再侵染新害虫。 Ph.D Dissertation ofFujianAgrieult、ireandForestryUniversity 营养条件对萌发、生长和产抱的影响 研究了12种碳源、10种氮源、6种金属离子和6种维生素对粉虱座壳抱的抱子萌发率、 菌丝生长和产抱量的影响。大多数碳源不影响该菌抱子萌发,而D一木糖、D-果糖、D一半乳 糖对其萌发有极显著的抑制作用。最有利于菌丝生长的碳源为可溶性淀粉,其次为蔗糖、 甘露醇和山梨醇。碳源极显著地抑制产抱,其中肌醉的抑制能力最强。酵母浸粉、胰蛋白 陈、干酪素、蛋白陈和牛肉浸膏最能促进抱子萌发,可是硝酸钠、尿素和酵母浸膏明显抑 制抱子萌发。胰蛋白陈、干酪素和牛肉浸膏最有利于菌丝生长,其次系蛋白陈和酵母浸膏。 所有氮源均有利于增加产抱量,其中酵母浸粉、胰蛋白陈和酵母浸膏为最好的产抱氮源, 而硫酸按的作用最小。2112十能显著地促进抱子萌发,而Cu2+强烈地抑制菌丝生长。除了FeZ十 极显著地促进产抱外,其它金属离子对产抱均表现出抑制作用。VB,、VBS、Vc和VB6均促 进萌发,其中VBS效果显著。这些维生素对菌丝生长均无显著影响,但极显著地抑制产抱, 其中VB6的抑制效果最明显。 与农药的兼容性 用6种大田常用农药在推荐浓度下,研究其在25℃下对座壳抱菌抱子萌发和菌丝生 长的影响,发现甲氰菊酩和克蜗特抑制其抱子萌发和菌丝生长,表明二者与本菌极不相容。 毗虫琳、水胺硫磷和双甲胖能促进抱子萌发且后两者亦加速菌丝生长,多菌灵对其抱子萌 发起暂时促进作用然而抑制其菌丝生长。 次生代谢产物 基于生物测定,从昆虫病原真菌粉虱座壳抱的有机提取物中分离出包括内毒素和外毒 素的次生代谢产物。这些产物对烟粉虱、桃蚜、白纹伊蚊幼虫的效果在室内进行了测试。 2龄粉虱对内毒素敏感,两天的LDS。为2.39m岁1111。相同浓度(2 .6m以ml)不同组分的内 毒素对3龄蚊子呈现出不同的活性。可是,内毒素对桃蚜无杀虫效果。此外,真菌外毒 素对上述昆虫均存在杀虫活性。其中,6林岁ml、8林ghlll和10“g八111的初提物可分别使 %.57%桃蚜、93.63%粉虱和94.12%伊蚊致死。座壳抱菌外毒素对蚜虫和蚊子具有杀虫 活性未见报道。因此,这是一个新的毒素资源。 分子遗传分析 在合适条件下,座壳抱菌可使粉虱和介壳虫致病。借助于RAPD、285:DNA盯LP和 Lsu:DNA研究了A.ale,I’odis、A月”胡。rala、A.扭rbinala和A.goldian口的遗传变异和系 统发育关系。用巧个引物和4种限制性内切酶对不同地理来源的4种座壳抱Aschersonia 进行RAPD和RFLP分析,结果表明种间和种内具丰富的遗传多样性,并且种间差异大于 种内差异。菌株间差异与地理来源、寄主不相关。系统发育树所反映的种间、种内关系与 形态分类结果基本一致,可以清楚地将不同地理来源的不同种区分开来,但从同科或同目 寄主


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