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《福建农林大学》 2003年
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全人工合成SCH基因、植物表达载体的构建和转基因籼稻的获得

陈志厚  
【摘要】:虫害严重影响着农业生产,转基因抗虫植物是控制害虫的最有效手段之一。但是随着转基因抗虫植物的大面积推广,昆虫会逐渐对其产生抗性。人工合成新的杀虫基因不仅拓宽了现存基因的杀虫谱,而且是延缓昆虫对转基因抗虫植物产生抗性的一种有效策略。 本研究主要进行了如下工作: 1.以获得抗双翅目害虫如稻瘿蚊的转基因抗虫水稻为目的,将来源于细菌cry11Bal基因(NCBI:X86902,其编码的81,293Da伴孢晶体蛋白,对双翅目害虫具有较高的毒性),在不改变其原有氨基酸序列的前提下,根据密码子的简并性及水稻密码子的偏好对其核苷酸全序列进行下列人工改造设计:将CTTCGG发夹(环)、聚合酶Ⅱ终止序列CAN_(7-9)AGTNNAA、植物一致剪接位点:5′=AAG:GTAAGT和3′=TTTT(Pu)TTT(Pu)T(Pu)T(Pu)T(Pu)TGCAG:C从苏云金芽孢杆菌基因的DNA序列中消除;消除其编码毒性区部分的44处植物潜在的poly(A)加尾信号序列、4处在真核系统内可能引起转录产物不稳定的ATTTA序列、66处AT富集区(多于5个连续的A—T的区域)、以及1处内含子切割序列CATTG;优化其密码子及提高基因序列的G+C含量;优化DNA序列中常见的限制性内切酶酶切位点;在改造后cry11Bal基因的5′非翻译区前端加上Kozak序列和信号肽(signal peptides)序列,在3′非翻译区末端加上内质网滞留信号HDEL序列和双终止子序列。在上述人工改造修饰原则上确定了全人工合成基因的核苷酸序列,合成后的基因取名为SCH(Signal-Cry11Bal-HDEL)。 2.通过连续延伸PCR方法扩增得到了全改造后的SCH基因全序列,新合成的基因克隆到通用载体pBluescriptⅡSK上,测序结果和人工设计的序列完全一致。改造后的基因与天然的cry11Bal基因有74%的核苷酸序列同源性,总共修改了725个密码子中的477个,改变幅度达到65.8%。改造后的基因总的G+C含量和密码子第三位碱基G+C含量分别由原来的32.97%及20.69%,提高到49.42%与65.10%。 3.构建了SCH基因单子叶植物表达载体pC1300ASCH、pC1300USCH、pCMASCH-Hyg、pCMUSCH-Hyg,以及SCH基因与cry1A(c)基因双价单子叶植物表达载体pC1300ASCHUc、DC1300USCHUc、pCMASCHUc、pCMUSCHUc,上述载体可用于水稻转化。其中pCM系列载体带有双MAR、双T-DNA序列,这一双T-DNA载体具有独立的两个T-DNA,一个T-DNA为标记基因部分,标记基因为潮霉素抗性基因hyg;另 全人工合成SCH基因、植物表达载体的构建和转基因釉稻的获得 一个T-DNA为含有占〔万基因的表达结构,两段独立的T-DNA在一定的条件下共同转化 植物时,可能整合到植物基因组的不同染色体上,转基因植株在自交后代发生分离,可 得到无选择标记的转基因株系。 4.电激将上述植物表达载体转入根癌农杆菌LBA4404中。用农杆菌介导法转化优良 釉稻恢复系明恢86幼胚诱导的胚性愈伤组织,经过30个批次转化,共获得潮霉素抗性 愈伤2 57个。其中转PC 1 300^seH载体的抗性愈伤172个、转pe一300UsCH载体的抗性 愈伤20个、转PC1300AscHUe载体的抗性愈伤64个、以及转Pc1300UsCHUe载体的 抗性愈伤31个。 5.转基因水稻植株经过PcR检测,证明己经得到了转‘C厅单基因和转占CH-卿1A(c) 双基因的水稻植株。对部分转基因水稻叶片的Bt蛋白表达量进行了ELISA检测,结果表 明,转基因植株所表达Bt蛋白含量平均占水稻叶片总可溶性蛋白的0.243%,初步证实了 全人工合成名CH基因已经导入水稻中,并实现了表达,其毒蛋白表达量比野生型荃因提 高250倍左右。 6.T0代转基因水稻种子通过句公标记基因分离检测,有l。%符合3:1分离、38.3%符 合l:l分离,有少数株系接近纯合,另有一部分发生无规律分离。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S511.21

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【参考文献】
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