纹枯病菌侵染后水稻防御反应相关基因的表达分析

【摘要】：水稻纹枯病是水稻三大病害之一,由于病原菌的寄主范围广和土壤习居性, 且缺乏有效的抗源,严重威胁世界稻米生产。采用从福建稻田分离纯化的纹枯病 菌株(FJ-15)接种籼稻9311,分别于接种后O、4、12、24、36、48和72h取样, 提取各样本的总RNA,以水稻PR1(Pathogenosis -related protein 1)和 PBZ1(Probenazole -inducible Protein)基因片段为探针进行Northern blot杂 交,分析水稻受纹枯病菌侵染后病程相关蛋白基因的表达动态,同时对相应时间 段的组织和症状变化进行了观察。Northern blot分析表明:PR1在接种12h后 开始表达,在之后的四个时间段其表达量逐步增强;而PBZ1亦在12h开始表达, 在48h表达量激剧增强。组织和症状观察结果表明,接种12h后叶鞘表面菌丝纵 横分枝,接种36h后出现零星病斑,接种48h后表现典型的受害症状,接种72h 后病斑继续扩大,并可蔓延到非接种叶鞘。综合以上的结果,我们认为PR1和 PBZ1的表达动态与水稻和纹枯病菌亲和互作的过程存在对应关系,推出水稻对 纹枯病菌的抗性反应可能受水杨酸途径调控。 鉴于两个病程相关蛋白基因的表达情况,选取4h、12h、24h、48h四个时间 段的水稻材料,以接种纹枯病菌的水稻mRNA作为tester,正常组织的mRNA为 driver进行抑制消减杂交,将抑制消减杂交的第二轮PCR产物转化T载体构建 包括2784个克隆的cDNA文库。以正向探针(接种纹枯病菌的水稻mRNA作为 tester,未接种对照组织的mRNA为driver,进行SSH(实验后的第二轮PCR产物) 和反向探针(接种纹枯病菌的水稻mRNA作为driver,正常组织的mRNA为test, 进行SSH(实验后的第二轮PCR产物):采用菌落杂交的方法筛选cDNA文库,将获 得的差异克隆以接种和未接种的水稻样品cDNA为探针进行反向Northern blot 分析进一步鉴定出受纹枯病菌诱导表达的水稻防御反应相关基因。挑取反向 Northern blot杂交结果差异明显的64个克隆进行测序,共得到53个非冗余序 列。所得EST序列与基因组数据库进行BLASTn水平上的比对,发现它们均为水 稻基因组序列。进一步进行BLASTx水平比对分析这些基因的可能的功能,结果 发现所有的53条EST序列中有33条序列与基因数据库中已报道的序列氨基酸水