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《福建农林大学》 2006年
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番木瓜环斑病毒HC-Pro、NIb和CP基因的原核表达及其抗体制备

黄小恩  
【摘要】:番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)是马铃薯Y病毒属的典型成员,是番木瓜病害中的主要病原,造成世界番木瓜生产上的主要损失。PRSV是由单一ORF编码的,多聚蛋白表达后再分解成各个功能蛋白。本文对采自福建农林大学校区的被PRSV感染的番木瓜病叶样本进行研究。对PRSV中的HC-Pro、NIb和CP编码基因进行扩增克隆、原核表达、GST融合蛋白抗体制备和系统进化分析及基本生物信息学分析。 通过Trizol法提取PRSV的总RNA。根据台湾的YK分离物、美国夏威夷的HA分离物、墨西哥分离物、泰国分离物的基因组全长中的较保守序列区域分别设计引物,通过RT-PCR方法扩增出特异性目的条带。PCR扩增产物经回收、连接、转化DH5α大肠杆菌克隆至pMD18-T载体上,经蓝白斑和氨苄青霉素抗性筛选和双酶切法鉴定,分别获得了重组质粒pMD-HC、pMD—NIb和pMD—CP。再经过双酶切,把目的基因连接到表达载体pGEX-4T-1上,分别获得了pGEX-4T-HC、pGEX-4T-NIb和pGEX-4T-CP重组表达质粒,并对它们进行了序列测定和分析。经过BLAST程序比对,HC-Pro的核苷酸序列与台湾的YK分离物(X97251)的HC-Pro在核苷酸水平上同源性最高,达到90.63%,在氨基酸水平上与泰国的PRSV-P株系(AAO16605)同源性为97.82%。NIb的核苷酸和序列与中国华南SM分离物(X96538 S76059)同源性最高,达到90%,在氨基酸水平上与泰国的PRSV-W株系(AAG47346)同源性最高,达到95%。CP基因的核苷酸序列与一个登录号为D50591的同本分离物同源性最高,达到95%。在氨基酸水平上与一个登录号为PAAO16605泰国的泰国分离物同源性最高,达到93%。另外,在CP、NIb和CP蛋白的氨基酸水平上构建了系统进化树,结果表明我国福建本地的PRSV与泰国分离物的PRSV的亲缘关系较近。 本文利用pGEX-4T-1的GST标签进行目的蛋白的融合表达,分别构建了pGEX-4T-HC、pGEX-4T-NIb、pGEX-4T-CP表达载体,并在BL21大肠杆菌中获得高效表达。最后将获得的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清,经过问接ELISA测定表明效价较高。Western blot鉴定表明抗血清特异性较强。表达载体的构建、表达产物及多克隆抗体的获得为下阶段的深入研究提供了实验材料。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:S436.67

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