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《福建农林大学》 2006年
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黄瓜几种主要病害的ELISA检测研究

李龙生  
【摘要】:黄瓜角斑病、黑星病、炭疽病是我国黄瓜生产上重要病害,各地发生普遍,常年为害,严重影响蔬菜生产安全。黄瓜红粉病、褐斑病是近年来北方地区新发生病害,蔓延加剧的趋势明显。病害诊断是病害防治的关键,常规诊断方法存在经验性强、时有误诊发生的特点。有鉴于此,本研究目的在于建立了一套快速、准确、灵敏的检测方法,用于黄瓜角斑病、黑星病、炭疽病、红粉病和褐斑病的诊断,为病害防治提供依据。 经过对ELISA检测黄瓜病害方法的研究与验证,确定了病原真菌和细菌的抗原制备方法,分析了2种抗血清纯化方法的特点和效果,确立了ELISA检测病害的质量控制参数,证实了ELISA用于病害诊断的可行性,为农业病害诊断试剂盒的推广应用提供参考。 利用液体培养基培养病原真菌(黄瓜黑星病菌、炭疽病菌、红粉病菌、褐斑病菌),解决了一些病菌在固体培养基上产生菌丝量少的困扰,为大规模提取菌丝蛋白作抗原建立了可行的模式;采用NA培养基培养黄瓜角斑病菌,灭活后离心洗涤制备菌体抗原。该法制备抗原较提取病菌某一组分作抗原简单,成本低,而且免疫效果能满足病害检测要求,抗血清终点效价都超过20,000。 选取报道的4种常用包被液分别包被抗原进入ELISA程序,研究了各种包被液对检测效果的影响。证实以0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液包被抗原效果最好,对大多数试剂盒适用。 比较了硫酸铵分步盐析和冷乙醇沉淀2种抗体纯化方法,证实硫酸铵盐析在纯化IgG抗体上的优势。利用改良过碘酸钠法对初步纯化抗体进行HRP标记,结果表明该法可行,省略了通行的抗血清盐析和标记后进一步纯化的步骤,但对效果会有一定影响。 方阵滴定确定了各种病菌所对应抗体最适工作浓度,抗体工作浓度在1-20μg/mL之间。 模拟田间检测,表明研制的ELISA试剂盒检测灵敏度在ng水平(菌丝蛋白),分别为黑星病菌小于500ng/mL、炭疽病菌50ng/mL、红粉病菌250ng/mL、褐斑病菌50ng/mL,对角斑病菌的检测灵敏度为4×10~4CFU/mL;准确性好,模拟田间检测准确
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:S436.421

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